自然發酵牛乳中乳酸菌和酵母菌的活菌動態變化

徐偉良，李春冬，雅 梅，2，郭 梁，2

（1.錫林郭勒職業學院 生物工程研究院，內蒙古 錫林浩特 026000；2.錫林郭勒職業學院 食品檢驗檢測和風險評估中心，內蒙古 錫林浩特 026000）

微生物廣泛存在于自然界中，有著極高的多樣性和豐富度，并且這些微生物并不是單獨存在的，而是共存于微生物群落中，如乳酸菌與酵母菌常共生形成復雜的相互作用網絡[1]。人們很早就學會利用乳酸菌與酵母菌作為益生菌用于生產、生活，例如，日常生活中常見的泡菜[2]、葡萄酒[3]、醋[4]、饅頭[5]及酸粥[6]等，也有如馬奶酒[7]、開菲爾[8]、干酪[9]、黃油[10]等通過天然微生物菌群生產的發酵乳制品。雖然乳酸菌和酵母菌之間的相互作用對產品的質地、風味及生物保健功效等起著不可代替的作用[11-12]，但目前對于乳酸菌和酵母菌相互作用機理還處于推測階段，多數學者認為乳酸菌與酵母菌之間可能存在代謝產物互補機制，以及通過信號分子進行信息交流，來調控相關基因的表達[13-14]。隨著對微生物代謝途徑的深入理解以及限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，FISH）等現代分子生物學技術的不斷發展，乳酸菌與酵母菌的相互作用機理勢將得以闡明，從而對更廣泛挖掘和利用微生物資源具有重要的理論意義和實際應用價值[15]。

自然發酵乳制品是指以乳（包括馬乳、牛乳、駝乳、羊乳、牦牛乳等）為原料，經微生物自然發酵，形成的主要產物為乳酸的乳制產品[16]。我國發酵乳制品的制作歷史悠久，制作工藝源遠流長，據記載，北方游牧民族早在2 000多年前由于游牧生活的需要，就有制作和食用自然發酵乳制品的習俗[17]。發酵乳制品利用環境中的微生物進行自然發酵，不僅保留了乳品的天然品質特色，而且其中蘊藏著豐富的乳酸菌和酵母菌資源。

本研究通過構建自然發酵牛乳體系，對不同發酵時期乳酸菌和酵母菌的活菌動態變化進行研究，有助于深入了解自然發酵過程中乳酸菌和酵母菌的變化規律以及相互作用，為進一步工業化鮮制奶酪的生產以及富含乳酸菌和酵母菌的功能發酵乳的研發奠定科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

新鮮牛乳：每隔1 d從錫林郭勒盟溪沐力克乳品有限公司采集同一種群奶牛的三個批次新鮮牛乳（A、B、C），三個批次新鮮牛乳的感官、理化及微生物指標檢測基本一致，每批次100 kg。

1.1.2 培養基與試劑

MRS培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：北京路橋技術股份有限公司；氫氧化鈉、酚酞（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HWS-250BX恒溫恒濕培養箱：天津泰斯特儀器有限公司；SW-J-2FD凈化工作臺：蘇州博萊爾凈化設備有限公司；Lactoscan LWA乳成分分析儀：杭州麥力斯科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 初始奶源質量品質檢測

感官指標的測定：將100 kg新鮮牛奶經過濾除雜后，取適量試樣置于50 mL燒杯中，在自然光下觀察色澤和組織狀態，聞其氣味，品嘗滋味，對其進行色澤、風味、組織狀態等感官指標評價[18]。

理化指標的測定：采用酸度計直接測定樣品pH值；參照國標GB 5009.239—2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》[19]中的方法測定酸度；利用乳成分分析儀測定蛋白質、脂肪、乳糖、非脂乳固體等理化指標[20-21]。

微生物指標的測定：參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[22]對初始奶源乳酸菌進行計數；參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》[23]對初始奶源酵母菌進行計數。

將連續3個批次（A、B、C）均符合GB 19301—2010《食品安全國家標準 生乳》[18]中感官、理化要求，并且檢測的微生物指標（乳酸菌與酵母菌）基本一致的牛乳作為后續自然發酵的原料乳。

1.3.2 自然發酵牛乳樣品的采集

將符合上述檢測指標的新鮮牛乳倒入敞開式發酵池中，環境溫度控制在（20±1）℃條件下，自然發酵72 h，每隔8 h取樣一次，連續采集10次，現場測定pH值和溫度，并將樣品裝入無菌采樣袋中4 ℃低溫保存，盡快送回實驗室進行乳酸菌和酵母菌計數。

1.3.3 自然發酵牛乳樣品中乳酸菌和酵母菌計數

取1 mL采集的新鮮自然發酵牛乳樣品加入到含9 mL 0.85%生理鹽水的試管內，進行梯度稀釋，選取3個適宜的梯度，涂布于MRS培養基和PDA培養基。將MRS平板倒置于37 ℃恒溫培養箱中，厭氧培養3 d；PDA平板正置于28 ℃恒溫培養箱中，培養5 d。參照方法1.3.1對自然發酵牛乳樣品中的乳酸菌和酵母菌進行計數。

1.3.4 統計分析

每批次樣品的理化指標檢測與乳酸菌和酵母菌計數結果均重復測定3次，采用SPSS 20.0分析軟件進行數據分析。利用單因素方差分析與t檢驗方法，在α=0.05顯著水平下進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 初始奶源質量品質檢測結果

通過對初始新鮮牛奶的感官評價、理化及微生物指標檢測，以保證牛乳來源的質量品質，從而排除奶源對后續自然發酵試驗條件的影響。感官評價結果顯示，連續三個批次的新鮮牛乳色澤均為乳白色，有固有的乳香味，無異味，組織狀態均勻一致，無凝塊及沉淀。故三個批次的牛乳感官評價相一致，符合奶源一致性要求。其理化指標檢測結果見表1，微生物指標檢測結果見表2。

表1 初始奶源理化指標檢測結果Table 1 Determination results of physicochemical indexes of initial milk

表2 初始奶源微生物指標檢測結果Table 2 Determination results of microbial indexes of initial milk

由表2可知，三個批次初始牛乳樣品（A、B、C）的pH值、酸度、蛋白質、乳糖、非脂乳固體含量均無顯著差異（P＞0.05），C批次初始牛乳脂肪含量顯著高于A與B批次（P＜0.05），而A批次與B批次牛乳脂肪含量差異不顯著（P＞0.05）。其中脂肪、蛋白質及非脂乳固體含量均符合GB 19301—2010《食品安全國家標準生乳》[18]（脂肪≥3.1%，蛋白質≥2.8%，非脂乳固體≥8.1%）中要求。由于pH值和酸度能夠間接反映牛乳的發酵程度，因此，對于初始奶源中pH值和酸度的檢測對描述初始牛乳發酵程度具重要意義。連續三批次初始牛乳樣品（A、B、C）的pH值和酸度均無顯著差異（P＞0.05），從而推測奶源處于同一初始發酵程度。

由表2可知，三個批次初始牛乳樣品（A、B、C）中乳酸菌活菌數經無顯著差異（P＞0.05）；而對于酵母菌活菌數，A批次初始牛乳顯著高于B與C批次（P＜0.05），而B批次與C批次牛乳差異不顯著（P＞0.05），這可能與三批次初始牛乳樣品來自同一個牧場的奶源有關。由此可知，三批次初始牛乳間的乳酸菌數和酵母菌整體波動范圍較小，可作為三次獨立材料用于后續自然發酵試驗。

2.2 自然發酵牛乳溫度與pH變化情況

2.2.1 自然發酵牛乳溫度的變化

傳統發酵牛乳的制作工藝是將新鮮牛奶不經過殺菌處理，直接過濾除雜后放入干凈容器中，靜置在蒙古包或室內的陰涼處自然發酵，發酵溫度在20 ℃左右，發酵時間為夏季1～2 d，冬季3～4 d[24-25]。在自然發酵的后期，乳脂會隨著發酵環境的變化富集在表層形成白色稠狀物質，即為奶嚼口（民族傳統乳制品），而酪蛋白經蛋白酶水解與水形成下層凝乳[26-27]。本實驗利用空調設備將外部環境溫度維持在（20±1）℃，通過對不同發酵時期樣品的發酵溫度進行測定，來監控溫度對其發酵情況的影響，其結果見圖1。

圖1 自然發酵牛乳發酵過程中發酵溫度的變化Fig.1 Changes of fermentation temperature during naturally fermented milk fermentation process

由圖1可知，三個批次牛奶樣品的初始溫度平均值為（8.03±1.31）℃，隨后樣品的溫度逐漸上升并基本維持在16 ℃左右，其中上層奶嚼口和下層凝乳樣品的溫度變化基本一致。因此，推斷模擬牛乳自然發酵狀態下，環境溫度基本保持在同一波動幅度，對發酵牛乳中微生物的生長變化影響較小。

2.2.2 自然發酵牛乳pH值的變化

pH值對微生物的生命活動有很大的影響，而微生物對pH條件的不同要求在一定程度上反映出微生物對環境的適應能力。本實驗對牛乳不同發酵時間階段牛乳的pH值進行監測，結果見圖2。

圖2 自然發酵牛乳發酵過程中pH值的變化Fig.2 Changes of pH during naturally fermented milk fermentation process

由圖2可知，三批次牛奶樣品發酵過程中pH值的變化趨勢基本一致，在發酵前32 h時，pH值下降不明顯，平均pH值只降低了0.29±0.085，隨后pH值呈快速下降趨勢，當pH值下降至5左右時，發酵牛乳開始出現分層現象，乳脂不斷上浮形成上層的奶嚼口，而下層乳基隨著pH值不斷下降，當pH值下降至4.6左右時，逐漸形成下層凝乳。并且奶嚼口在不同發酵階段的pH值明顯低于下層凝乳，因此，推測奶嚼口和下層凝乳中微生物生長變化存在一定的差異，具體還需對乳酸菌與酵母菌的計數進行驗證。

通過上述三批次自然發酵牛乳中pH值變化均呈先緩慢下降后快速下降的趨勢，推測這與發酵牛乳酸凝乳過程有關。牛乳中酪蛋白常以酪蛋白-磷酸鈣復合體形式存在于牛乳溶膠中，酸凝乳方式則是利用乳酸菌發酵分解乳糖產酸或添加食用酸使原乳pH值下降從而誘導酪蛋白膠束聚集，逐漸形成凝乳[28]。通過對發酵牛乳中溫度及pH值變化的研究表明，在（20±1）℃的自然發酵溫度下，持續發酵56 h后，發酵牛乳的pH值下降至pH 4.6～5.0時，發酵牛乳會出現分層并形成上層奶嚼口和下層凝乳。

2.3 自然發酵牛乳中乳酸菌和酵母菌的動態變化

一般微生物的生長繁殖有一定規律性，典型的可分為延遲期、對數期、穩定期和衰亡期4個階段[29]。本實驗對不同發酵階段的乳酸菌和酵母菌分別進行活菌計數，用以研究自然發酵牛乳中微生物的生長動態變化，結果見圖3。

圖3 自然發酵牛乳發酵過程中乳酸菌和酵母菌數的變化Fig.3 Change of lactic acid bacteria and yeast counts during naturally fermented milk fermentation process

由圖3可知，綜合評價三批次自然發酵牛乳發酵過程中乳酸菌和酵母菌的活菌動態變化后發現，乳酸菌的生長變化趨勢與微生物生長所具有的延遲期、對數期、穩定期三個典型階段相類似。在生長初期有近16 h的緩慢生長階段，隨后進入快速增長階段，乳酸菌數不斷增加。酵母菌的生長與乳酸菌相比，并沒有出現明顯的快速增長階段，在生長初期呈平穩上升趨勢，在發酵24～32 h時達到第一次生長峰值，隨即生長逐漸下降，而此時乳酸菌正處于快速生長階段。因此，推測在乳酸菌處于快速增長階段時，酵母菌呈先增高后下降的現象可能是由于自然發酵過程中乳酸菌和酵母菌在開始表現出協同關系，隨著乳酸菌的快速生長而抑制酵母的增多。例如有研究者報道乳酸菌和酵母菌混合培養的抑制作用表現在乳酸菌產生的代謝產物如苯乳酸、4-羥基-苯乳酸、環肽類物質抑制了酵母菌的生長[30]。

隨著發酵時間的延長，當發酵牛乳出現分層現象后，上層奶嚼口和下層凝乳中的乳酸菌和酵母菌的生長又呈現不同的變化。三個批次奶嚼口和下層凝乳中乳酸菌和酵母菌活菌數見表3。

由表3可知，在發酵牛乳分層后的56 h、64 h、72 h三個發酵階段，上層奶嚼口和下層凝乳中乳酸菌的平均活菌數分別為（12.02±1.21）lg（CFU/mL）、（11.54±1.30）lg（CFU/mL），兩者間兩者間沒有顯著差別（P＞0.05）；而上層奶嚼口和下層凝乳中酵母菌平均活菌數分別為（6.39±0.60）lg（CFU/mL）、（4.56±0.30）lg（CFU/mL），上層奶嚼口顯著高于下層凝乳中的酵母菌平均活菌數（P＜0.05）。此結果恰能說明由圖2中奶嚼口的pH值明顯低于下層凝乳推測奶嚼口和下層凝乳中微生物生長變化存在一定的差異的假設。對于上層奶嚼口中酵母菌數量增加的情況推測可能原因是上層奶嚼口暴露在空氣中形成了高脂和高溶氧的環境促進了酵母菌的生長。如有學者認為酵母菌對脂肪酸的水解能力較強，并且分解脂肪產生出的游離脂肪酸可能會抑制乳酸菌的生長[31]。

乳品的自然發酵過程非常復雜，涉及微生物和生化變化。FOX P F等[32]研究奶酪的成熟過程發現，微生物的成熟包括初始發酵細菌的死亡和自溶，不定菌群（非發酵乳酸菌）的生長和繼發微生物群生長。在奶酪成熟過程中，首先是起始細菌快速繁殖，在奶酪菌群中占主導地位，但大多數細菌都會很快死亡和裂解，并釋放肽酶等多種細胞內酶，與凝乳酶一起將酪蛋白水解為肽和氨基酸，為后續菌群的生長提供營養物質。而非發酵乳酸菌多為異發酵乳桿菌和專一性異源發酵乳桿菌，繼發微生物群多涉及短桿菌、微球菌、酵母菌和霉菌等，它們常常一起參與奶酪的成熟過程。因此，自然發酵牛乳微生物的生長中不僅受群落內部物種間交互作用的影響，還受到環境和空間因素對多樣性的影響，整體處于動態變化的過程。

3 結論

本實驗對自然發酵牛乳中乳酸菌和酵母菌的活菌動態變化分析表明，在（20±1）℃的自然發酵溫度下，持續發酵56 h后，pH值下降至4.6～5.0范圍時，自然發酵牛乳出現分層并形成上層奶嚼口和下層凝乳；其中奶嚼口和凝乳中乳酸菌的活菌數無顯著差異（P＞0.05），而凝乳中酵母菌活菌數顯著低于奶嚼口（P＜0.05）。乳酸菌的生長具有延遲期、對數期、穩定期三個典型階段，酵母菌并沒有典型的對數期增長；在自然發酵過程中乳酸菌和酵母菌開始表現出協同關系，隨著乳酸菌的生長反而抑制酵母菌的增多。通過模擬自然狀態下牛乳的發酵條件，初步分析了乳酸菌和酵母菌的動態生長變化和相互作用，將有助于為下一步富含乳酸菌和酵母菌的功能發酵乳的研發奠定科學基礎。