一株紫色紅曲霉菌強化制曲的工藝優化

程 偉，張 杰，潘天全，李 娜，吳 龍，時玉英，吳麗華，吳宏萍

（1.安徽金種子酒業股份有限公司，安徽 阜陽 236023；2.安徽金種子集團有限公司檢測中心，安徽 阜陽 236018）

紅曲霉作為傳統食品加工的特殊微生物，主要用于生產紅曲[1]。紅曲是以大米為主要原料，經紅曲霉固態發酵而制成的一種米曲，紅曲米含有抗氧化和抗腫瘤等活性成分[2]。紅曲霉耐高溫，生長溫度范圍在15～45 ℃，最適生長溫度為25～30 ℃，最適生長pH值為3.5～5，耐pH最低為2.5，嗜乳酸，耐乙醇濃度為10%vol[3]。多數紅曲霉能代謝產生紅曲色素，產生的色素進入培養基中，進而使培養基的背面呈現出不同的顏色[4]。紅曲霉生長過程中能產生多種酶類（如淀粉酶、糖化酶、酯化酶等），用于制備紅曲米醋或紅曲麩曲；有些菌株還能代謝產生較高活性的蛋白酶，用于腌制“色、香、味”俱佳的紅曲腌漬魚、肉或豆腐等高蛋白食品[5-6]。

白酒釀造中的酯化菌主要包括霉菌和酵母菌等，其主要來源于釀酒大曲，市售的商品酯化紅曲復合酯化酶生態菌劑主要用于提高原酒的出酒率和優質率等，生產應用效果明顯[7-8]。

為研究分離篩選自企業的紅曲霉菌株的制曲生產特性，優化該菌株酯化紅曲的制備工藝，以制備適合白酒釀造的酯化紅曲，本研究通過對紅曲霉菌株ZHX9進行液體培養，再分別以大米、麩皮及混合料等為原料進行純種培養，選取種子液添加量、培養溫度、培養時間和曲料含水率等作為影響因素，以強化制曲的酯化力為考察指標，優化酯化紅曲的制備工藝，該研究可為紅曲霉菌株ZHX9的制曲生產應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

制曲原料（麩皮、大米、稻殼等）：金種子酒業制曲車間；紅曲霉（Monascus purpureus）ZHX9：金種子酒業微生物實驗室；葡萄糖、NaNO3、MgSO4·7H2O、乳酸等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

種子液培養基：葡萄糖70 g，牛肉膏15 g，NaNO32 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.5 g，水1 000 mL，pH自然。斜面培養基：種子液培養基加瓊脂15～20 g。米曲培養基：大米浸泡1～2 h后瀝水，常壓蒸40～60 min左右至米飯蒸透而不粘手，攤晾冷卻至35 ℃左右。麩曲培養基：麩皮添加適量的清水，并翻拌均勻后瀝干無明水，含水率在50%左右，0.1 MPa蒸40～60 min左右，攤晾冷卻至35 ℃左右。混合料培養基：麩皮∶米粉∶干燥曲酒糟（96∶3∶1，g∶g）添加適量的清水，翻拌均勻后瀝干無明水，含水率在50%左右，0.1 MPa蒸40～60 min左右，攤晾冷卻至35 ℃左右。

1.2 儀器與設備

BXM-100VD立式壓力蒸汽滅菌器、BJ-2CD凈化工作臺：上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；HYG-W1恒溫搖床：上海欣蕊自動化設備有限公司；LHS-800HC-II恒溫恒濕培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；7890B氣相色譜儀：美國安捷倫公司；麩曲培曲框：本實驗室自制。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅曲霉菌株的的活化及其種子液培養

將紅曲霉菌株ZHX9轉接于斜面培養基上，30 ℃培養3～5 d活化，取0.5 cm2左右的菌塊接種到種子液培養基中，30 ℃、160 r/min恒溫搖床培養3～5 d，菌絲球生長均勻濃密，可在種子培養基中添加數顆玻璃珠以防止菌絲球過于集中生長。

1.3.2 強化制曲

攤晾冷卻后的米飯噴灑乳酸稀釋液，并接種10%左右的種子液，翻拌均勻后置于培養框內；培養框的下層及米料的表層均鋪設有2層已滅菌的醫用紗布，米料厚度在5～10 cm，置于恒溫恒濕培養箱內進行培曲，培養箱濕度100%，30 ℃間歇通風培養。以成品米曲的酯化力為評價指標，設置單因素試驗考察培養時間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）、培養溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、曲料水分含量（35%、45%、50%、65%、70%）、不同乳酸含量（0、2‰、4‰、6‰、8‰）等條件對強化米曲培養的影響。

1.3.3 菌株ZHX9的強化曲酶活檢測

強化曲的糖化力、發酵力等的測定參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》中的方法并略有調整[9]。酯化力的測定，稱取相當于5 g干曲的曲量，加入100 mL含1%己酸、20%vol乙醇的酯化體系中，32 ℃酯化100 h，加水50 mL蒸餾，接餾出液100 mL，用氣相色譜檢測反應體系中形成的己酸乙酯含量。酯化力定義：100 mL餾出液中含己酸乙酯的毫克數[10]。

2 結果與分析

2.1 菌株ZHX9的活化及其種子液培養

產酯化酶微生物液態發酵代謝產生的酯化酶具有催化發酵體系中有機酸酯的合成等作用，酯化酶催化反應既能利用發酵物料成分進行生化反應進而合成有機酸酯，當合成的有機酸酯達到一定濃度時，酯化酶又能分解產生的有機酸酯；隨著發酵體系反應時間的進行，發酵體系中剩余酯最多的時間點或酯化達到平衡的時間即為該產酯化酶微生物發酵的最佳培養時間[11]。紅曲霉液態發酵可產生包括紅曲色素、酯化酶等在內的多種酶類，以及具有降血脂功效的紅曲Monacolin K等特殊活性物質[12]，對液態發酵條件的優化研究有利于實現紅曲及其酶類制品的工業化擴大生產[13-16]。由圖1可知，活化后的保藏菌株ZHX9狀態良好，菌絲初為粉紅色，后顏色逐漸加深呈紫紅色，其菌落生長致密、可見氣生菌絲、培養基呈深紫紅色；斜面培養基的背面可見有明顯的菌落褶皺；成熟種子液的菌絲球與菌絲體呈混合狀態且生長濃密，種子液呈淡黃色，稍黏稠，氣味正常，稍有醇香。

圖1 紅曲霉菌株ZHX9的斜面保藏及其成熟種子液的培養特征Fig.1 Slope preservation of Monascus strain ZHX9 and culture characteristics of its mature seed solution

2.2 菌株ZHX9的米曲培養

由于大米等多孔基質的疏松程度不同，影響了空氣等物質的傳遞，導致菌體生長微環境的差異，因此，固態發酵具有典型的不均一性；其中，培養溫度、培養時間、曲料水分含量等對固態發酵紅曲米曲的培養質量具有重要影響[17]。

由圖2（a）可知，隨著培養時間的延長，固態發酵強化米曲的酯化力不斷增加；其中，當培養時間達到3 d時，強化米曲的酯化力達到715 mg/100 mL，培養5 d時強化米曲的酯化力變化不明顯，因此，確定強化米曲的培養時間為3 d較為適宜。由圖2（b）可知，隨著培養溫度的升高，固態發酵強化米曲的酯化力呈先升高后降低的趨勢，培養溫度為35 ℃時酯化力最高，之后略有下降。因此確定強化米曲的培養溫度為35 ℃較為適宜。曲料水分含量低會影響制曲微生物的生長，水分含量高時曲料容易結團且通氣性差，同樣不利于制曲微生物的生長，對成品麩曲及麩曲發酵產酒的酸度有不利影響，由圖2（c）可知，曲料水分含量在55%左右較為合適。與細菌和放線菌相比，多數霉菌更易在酸性環境下生長，曲料具有一定的酸度還有利于培曲前期雜菌的控制；由于紅曲霉具有耐乳酸的特性，因此，通過添加乳酸來調節曲料培養基的pH值，由圖2（d）可知，不同乳酸濃度對紅曲霉菌固態發酵合成酯化酶具有顯著的影響，在乳酸濃度為4‰時較為合適。綜合可知，紅曲霉菌株ZHX9的強化米曲較適宜的培養條件：培養時間為3 d，培養溫度為35 ℃，水分含量為55%，乳酸添加濃度為4‰。

圖2 菌株ZHX9強化米曲培養的主要影響因素考察Fig.2 Main influencing factors on culture of strain ZHX9 cultured by intensified Miqu

菌株ZHX9的強化米曲培養過程中的感官變化見圖3。由圖3可知，大米蒸煮后攤晾降溫到35 ℃左右，種子液的接種量為10%左右，噴灑4‰的乳酸并翻拌均勻；溫度35 ℃，濕度100%，間歇通風培養24 h，菌絲萌發，呈現乳白色，有的米粒呈現淡紅色；再培養48 h，菌絲生長旺盛、菌絲飽滿并深入到米粒內部，呈現淡紅色，以后逐漸加深，由淡紅色為深紅色，最后成為紫紅色，局部有橙紅色或黃色；培養過程中，每天觀察米料的品溫及干濕情況，及時噴灑無菌水或翻拌米料，翻拌米料時可以聞到有酒香氣味。培養3 d的成熟米曲，置于40 ℃通風干燥粉碎后得到的固體曲粉呈深紫紅色。

圖3 紅曲霉菌株ZHX9的強化米曲培養特征Fig.3 Characteristics of intensified Miqu culture of Monascus strain ZHX9

2.3 菌株ZHX9的麩曲培養

麩曲是以麩皮為原料，經蒸煮滅菌、冷卻等，接入純種釀酒微生物，在人工控制條件下經培養、低溫烘干而制備的散曲，主要有細菌麩曲、根霉麩曲和酵母麩曲等類型[18]。

曲料的含水量是制備麩曲過程中的重要因素，含水量過低，曲料過快干結，達不到制曲微生物生長需求的濕潤環境；含水量過高，會導致曲料結合緊密，曲料的供氧和散熱都受到影響，導致曲料溫度控制困難，從而影響制曲微生物的代謝產酶，由此可見，曲料的含水量對純種麩曲質量的影響較為明顯[19]。

菌株ZHX9的強化麩曲培養過程中的感官變化見圖4。由圖4可知，麩皮蒸煮后攤晾降溫到35 ℃左右，種子液的接種量為10%左右，噴灑4‰的乳酸并翻拌均勻，曲料含水量在55%左右；溫度35 ℃，濕度100%，間歇通風培養24 h，菌絲萌發，呈現乳白色；再培養48 h，菌絲生長旺盛、菌絲飽滿并深入到曲料內部，局部呈現淡紅色；培養過程中，每天觀察曲料的品溫及干濕情況，及時噴灑無菌水或翻拌曲料，翻拌曲料時可以聞到有明顯曲香。若成品麩曲的含水較高則對麩曲的保存、釀酒發酵條件的控制及產酒質量等產生不利影響；因此，培養成熟的麩曲應通風干燥，通常干燥溫度不高于40 ℃以保證酶的活力不受影響。烘干后的成品麩曲呈金黃色，局部呈灰褐色，比麩皮顏色略重，具有明顯曲香，無腐臭等異雜味。

圖4 菌株ZHX9的強化麩曲培養特征Fig.4 Characteristics of intensified Fuqu culture of Monascus strain ZHX9

2.4 菌株ZHX9的混合曲料培養

混合料培養基采用麩皮、米粉、干燥曲酒糟等，其質量比為96∶3∶1，添加適量的清水，并翻拌均勻后瀝干無明水，含水率在50%左右，0.1 MPa帶壓蒸40～60 min左右；再攤晾冷卻至35 ℃左右，添加10%左右的種子液，噴灑4‰的乳酸并翻拌均勻，曲料含水量在55%左右。混合曲料選用干燥曲酒糟等作為培養基輔料，由于干燥曲酒糟具有彈性，可以起到疏松曲料的作用，培曲過程中曲料中含有相當量的空氣，有利于紅曲霉菌株在有氧的情況下大量繁殖，并避免曲料發粘以及由于透氣性差所導致的發酸或發臭等現象，還有利于降低制曲的生產成本。

如圖5所示，菌株ZHX9的混合曲料培養過程中，由于干燥曲酒糟的添加增加了曲料的通透性與酸度，有利于紅曲霉菌的生長，菌株的萌發時間提前，且菌體的生長較快并深入到曲料內部，局部呈現紫紅色。干燥后的成品混合料曲呈淺紫紅色，局部呈褐色，具有明顯的曲香，無腐臭等異雜味。

圖5 紅曲霉菌株ZHX9的混合曲料培養特征Fig.5 Characteristics of enhanced mixed Qu culture of Monascus strain ZHX9

2.5 菌株ZHX9各培養料強化曲的酶活檢測

由表1可知，利用大米、麩皮或混合曲料制備菌株ZHX9的強化曲，其酯化力、糖化力等指標均比傳統釀酒大曲略高，其中米曲酯化力達到745 mg/100 mL，混料曲糖化力達到1 065 mg/（g·h），均表明紅曲霉菌株ZHX9具有較高的強化制曲應用前景。混合料制備酯化紅曲的指標與采用大米或麩皮等單獨作為原料制備的酯化紅曲差距并不明顯，混合料紅曲的糖化力與發酵力略高，混合料還具有生產成本低的特點，因此，采用混合料制備酯化紅曲具有明顯的優勢。

表1 菌株ZHX9的強化曲酶活檢測結果Table 1 Detection results of enzyme activity of intensified Qu of strain ZHX9

有研究表明，酯化紅曲通常采用麩皮、大米等作為生產原料，杜禮泉等[20]應用煙灰色紅曲霉制備麩曲，發現pH對麩曲的污染控制較為重要，當pH控制在4.3～4.8時可以有效避免麩曲培養過程中的污染問題，酯化率達到35%以上，采用黃水調整曲料的酸度明顯優于乳酸。李桂英等[8]采用純種紅曲霉制曲，以大米及麩皮制備種子，應用大米為主料再進行擴大培養，取得較好效果。制曲時對原料的處理、培曲過程中的補水及溫度調整、通氣控制等都有較高要求。關于利用大米、麩皮和稻殼等作為混合曲料制備菌株ZHX9的強化紅曲工藝方面，還應該針對配料比例，曲料的pH、含水量及微量成分添加，培曲條件等方面進行優化分析，以進一步提高成品混料酯化紅曲的質量。

3 結論

本研究對企業分離篩選的紅曲霉菌ZHX9進行液體培養，再分別以大米、麩皮及混合料等為原料進行純種培養，其中混合料明顯優于大米或麩皮等單獨作為原料制備酯化紅曲，在培養溫度35 ℃、培養時間3 d、曲料含水率55%、乳酸添加量4‰條件下，混合料成品酯化紅曲的酯化力為716 mg/100 mL、糖化力為1 065 mg/（g·h）、發酵力為2.01 g/（0.5 g·72 h），表明該菌株的酯化紅曲具有較高的應用價值。混合料采用麩皮、米粉、稻殼等為原料，各原料的添加比例以及混料曲培養過程中的條件控制等，還需要進一步優化分析，以提高成品混料酯化紅曲的質量。酯化紅曲傳統固體發酵中的有關機理及其制曲工藝、主要酯化酶的作用特性等還需要進一步研究。