牛蒡根際土壤中解鉀菌篩選、鑒定及解鉀條件優化

孫 科，耿鳳英，于秋菊，王 鋒

（徐州生物職業技術學院 藥品食品學院，江蘇 徐州 221006）

牛蒡（Arctium lappcL.）為菊科（Compositae）牛蒡屬（Synurus）植物，是一種典型的藥食同源植物[1]，含有蛋白質、菊糖、多種維生素和礦物質，其中胡羅素含量是胡蘿卜的150倍，蛋白質和鈣含量是根莖類植物之冠，具有降血壓、降血脂、抗病毒、抗腫瘤等作用[2]。中國牛蒡產量居世界第一[3]，而徐州市豐縣年產牛蒡28萬t，年銷售收入20億元，因此，徐州豐縣有“牛蒡之鄉”之稱[4]。

鉀是植物生長需要量最大的三大類必需營養元素之一，地殼中鉀元素含量約占2.47%，但是土壤中92%～98%的鉀是以礦物質鉀形式存在的[5]，是植物不能直接利用的。我國是一個土壤缺鉀嚴重的國家，目前約有0.3億hm2土地缺鉀[6]，并且我國鉀肥的儲量較小、開發難度大，每年需要大量進口鉀肥。以江蘇為例，江蘇每年大約需要鉀肥10萬t，但江蘇自給的鉀肥僅有0.15萬t，其余需要從俄羅斯等國進口[7]。轉化土壤中的無效鉀，提高土壤中有效鉀含量，是解決我國土壤缺鉀的一個有效途徑。土壤中存在一些通過自身的代謝作用，能夠把無效鉀轉化為植物可以直接吸收利用的有效鉀的微生物，稱其為解鉀菌（postassium bacteria）。60多年前，前蘇聯科學家亞歷山大羅夫[8]第一次發現硅酸鹽細菌以來，解鉀菌的研究從未間斷過并取得一定的進展。盛下放等[9]分離篩選到一株高效的解鉀菌NBT，解鉀率達到226.0%，大田試驗顯示對棉花有一定的增產作用；SUGUMARAN P等[10]篩選得到一株解鉀菌，可使土壤中有效鉀質量濃度達到99.60 mg/kg，植物干質量增加125%。

目前，關于解鉀菌報道較多，但解鉀菌的絕對解鉀量仍然不高，針對牛蒡專用解鉀菌的研究還沒有報道。因此，本研究從牛蒡根際土壤中分離篩選解鉀菌，通過形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術對其進行菌種鑒定，并通過單因素試驗和響應面試驗對其解鉀條件進行優化，最后，通過牛蒡盆栽試驗驗證其促生能力，為牛蒡專用有機肥提供解鉀微生物菌劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

通過5點取樣法在徐州市豐縣牛蒡標準化種植基地采集牛蒡根際5～15 cm深土壤樣本，采集后混勻裝入無菌牛皮紙袋密封，貼上標簽，4 ℃保存。

1.1.2 試劑

FeCl3、CaCO3、MgSO4·7H2O、Na2HPO4（均為分析純）：格里斯（天津）醫藥化學技術有限公司；酵母浸膏、蔗糖、瓊脂（均為生化試劑）：北京陸橋技術股份有限責任公司；鉀長石粉（K2O≥10%）：江西佳利生化高科有限公司；Taq聚合酶（2.5 U/μL）、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物純化試劑盒：上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.1.3 培養基

初篩培養基[11]：FeCl30.005 g/L，CaCO30.1 g/L，Na2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，蔗糖5.0 g/L，鉀長石粉（去離子水浸泡過夜，反復沖洗8～10次，陰干，去除可溶性鉀）1.0 g/L，瓊脂18 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.5。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

種子液培養基[12]：NaCl 0.1 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，CaCO31.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蔗糖10 g/L，酵母膏0.5 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。固體培養基中添加瓊脂粉20 g/L。

發酵培養基[13]：NaCl 0.1 g/L，CaCO31.0 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，Na2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蔗糖10.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，鉀長石粉（去離子水浸泡過夜，反復沖洗8～10次，陰干，去除可溶性鉀）10.0 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

改良LB液體培養基[14]：NaCl 10.0 g/L，L-色氨酸0.5 g/L，酵母提取物5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，雙蒸水1 000 mL；pH 6.8～7.2。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

HZ-124/85S半微量電子天平：上海諾宣科學儀器有限公司；HNY-200B恒溫搖床：上海喬躍電子科技有限公司；LH-PYX3M生化培養箱：常州金南儀器制造有限公司；VD-850臺式超凈工作臺：杭州旭清科技有限公司；MG96G型基因擴增儀：北京君意東方電泳設備有限公司；XW-80A漩渦混合器：廣森實驗器材有限公司；TDZ4離心機：青島諾凱達機械制造有限公司；UV2800S紫外分光光度計：上海力辰儀器科技有限公司；ICP-5000電感耦合等離子體發射光譜（inductivelycoupled plasma-optical emission spectrometer，ICP-OES）儀：北京吉天儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛蒡根際土壤中解鉀菌的初篩

稱取10 g牛蒡根際土壤，加入90 mL無菌去離子水中充分振蕩，采用10倍梯度稀釋至10-6，制備土壤懸液。取稀釋度為10-4、10-5、10-6的土壤懸液各100 μL均勻涂布于初篩培養基，每個濃度做3個平行，30 ℃倒置培養60 h。挑選菌落直徑大、圓形、表面濕潤的單菌落進行劃線純化，直至顯微觀察得到純菌種。

1.3.2 牛蒡根際土壤中解鉀菌的復篩

（1）有效鉀含量的測定

挑取初篩解鉀菌菌落接種到種子培養基，在37 ℃、200 r/min條件下培養至菌體濃為108CFU/mL作為種子液。按5%（V/V）的接種量將種子液接種于發酵培養基，30 ℃、200 r/min條件下培養6 d，以等量滅菌的種子液為對照組，每個菌落做3個平行。采用過氧化氫灰化法處理發酵液，利用電感耦合等離子體發射光譜（ICP-OES）儀測定處理后發酵液中鉀離子含量[15]，并計算有效鉀的相對增加率，其計算公式如下：

a=（ρ1-ρ0）/×100%[15]

式中：a：有效鉀增加率，%；ρ1：試驗組發酵液中有效鉀含量，mg/L；ρ0：對照組發酵液中有效鉀含量，mg/L。

（2）解鉀菌分泌吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）能力的測定

挑取初篩解鉀菌菌落接種到改良的LB液體培養基，37℃、200r/min條件下恒溫振蕩培養48h。取發酵液，10000r/min離心20 min，取上清液50 μL加入等體積Sackowchi's顯色劑，倒在白瓷板上避光觀察，30 min出現粉紅色為陽性，表示該菌株可以分泌吲哚乙酸（IAA）[16]。以接種滅活解鉀菌培養液為對照，取上述陽性菌株混合液，測定波長530 nm處的吸光度值，計算陽性解鉀菌株分泌IAA的量[17]。

1.3.3 解鉀菌株的鑒定

形態觀察[18]：借助顯微鏡進行菌株的形態特征觀察和菌落特征觀察。

生理生化特性鑒定：參考文獻[18-19]進行生理生化試驗。

16S rDNA序列分析[20]：利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取解鉀菌株的DNA，以其為模板，使用通用引物F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）PCR擴增16S rDNA基因。PCR擴增體系（20 μL）：10×PCR緩沖液2 μL，模板DNA 20 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）（10 mmo/L）0.45 μL，上、下游引物（20 μg/L）各0.25 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，加雙蒸水（ddH2O）至終體積。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃最后延伸10 min?；厥窄傊悄zPCR克隆片段連接到T載體，送至南京世和基因生物技術有限公司進行基因測序，測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫進行BLAST比對搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA，利用Mega 6軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.4 解鉀菌株解鉀條件優化

（1）單因素試驗

考察初始pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、發酵溫度（25 ℃、26 ℃、27 ℃、28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%（V/V））、培養時間（12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h）對可溶性鉀含量的影響，每個試驗做3個平行。

（2）響應面試驗

根據單因素試驗結果，以發酵溫度（X1）、初始pH值（X2）、接種量（X3）和發酵時間（X4）為自變量，以可溶性鉀含量（Y）為響應值，進行中心組合響應面試驗，試驗設計因素與水平見表1。

表1 解鉀條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for potassium-dissolving conditions optimization

1.3.5 盆栽試驗

對解鉀能力優化后的菌株進行盆栽試驗，選用0～25 cm耕層的土壤，將土壤風干粉碎后，裝入花盆中（底直徑25 cm，高29 cm），每盆裝3 kg，共裝20盆。將20盆土壤隨機分成2組（實驗組和對照組）。實驗組將發酵原液加入適量無菌水稀釋，把牛蒡種子浸入稀釋液中1～2 h，陰干后播種，剩余的稀釋液播種時一起施入土壤。對照組用等量的無菌水處理。30 d后測量牛蒡的株高、莖的直徑、葉片數和地上部分鮮質量。

1.3.6 數據處理

使用軟件Design Expert 8.0.6[21]對試驗結果數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 解鉀菌篩選

通過初篩共獲得36株具有解鉀能力的菌株。挑選直徑較大、圓形、表面濕潤的9個菌落進行復篩，對菌株進行編號，分別為PB-1、PB-2、PB-3、PB-4、PB-5、PB-6、PB-7、PB-8和PB-9，測定每株解鉀菌發酵液中的有效鉀含量，同時測定IAA產量，每株解鉀菌做3個平行，結果分別見表2和表3。

表2 9株菌株解鉀率的測定結果Table 2 Determination results of potassium-dissolving rates of 9 strains

表3 9株菌株產泌吲哚乙酸能力的測定結果Table 3 Determination results of indole-3-acetic acid production capacity of 9 strains

由表2可知，9株解鉀菌解鉀率較高，可溶性鉀的增加率在116%～136%之間，其中菌株PB-9發酵液中可溶性鉀的增加率最高，達到136%。比李新新等[22]篩選的類芽孢桿菌屬解鉀菌G4可溶性鉀增加率（127.6%）、李海龍等[23]分離篩選出的芽孢桿菌QL21的可溶性鉀增加率（25.1%）高。由表3可知，9株解鉀菌在改良LB液體培養基中培養24 h后，有7株菌株可以產IAA，其中菌株PB-9產IAA的能力最強，IAA產量達到38.64 mg/L。因此，選取菌株PB-9為研究對象，進行下一步研究。

2.2 解磷菌PB-9的鑒定

2.2.1 形態學鑒定

菌株PB-9在種子固體培養基上培養48 h后，菌落及細胞形態見圖1。由圖1a可知，菌株PB-9的菌落呈圓形，不透明，乳白色，表明光滑、隆起，邊緣濕潤。由圖1b可知，菌株PB-9革蘭氏染色陽性，多呈棒狀，單個或呈短鏈排列，大小約（1.2～1.5）μm×（2.0～4.0）μm，有芽孢、菌毛，有鞭毛，能運動。

圖1 菌株PB-9的菌落（a）及細胞（b）形態Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of strain PB-9

2.2.2 生理生化特征鑒定

表4 菌株PB-9的生理生化特性Table 4 Biophysical and biochemical characteristics of strain PB-9

由表4可知，菌株PB-9的生理生化特性與巨大芽孢桿菌的生理生化特性相同，結合菌落特征和顯微特征，初步鑒定該菌株為巨大芽孢桿菌（Bacillus megateriums）。

2.2.3 分子生物學鑒定

由圖2可知，菌株PB-9與巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）（GenBank：DQ462195）聚于一支，親緣關系最近。結合菌株PB-9的菌落特征、顯微觀察特征和生理生化特性，將菌株PB-9鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。對于解鉀菌的系統發育分類地位，得到國際公認的菌種包括：土壤芽孢桿菌（Bacillus edaphicus）[24]、環狀芽孢桿菌（Bacillus edaphicus）[25]、膠質芽孢桿菌（Bacillus mucilagionsus）[26]。但是，隨著國內外研究者對解鉀菌的深入研究，目前解鉀菌的種類出現了多樣化趨勢：陳宇豐等[27]從香蕉根際土壤中分離篩選出一株高效解鉀菌，經鑒定為陜西鏈霉菌（Streptomyeces shaanxiensis）；張朝輝等[28]從烤煙根際分離得到一株解鉀菌K03，通過形態觀察、生理生化特征及16S rDNA序列分析，鑒定為阿氏腸桿菌（Enterobacter asburiae）。姜霽航等[29]從蘋果根際土壤分離得到5株解鉀能力較強的菌株，經鑒定1株為不動桿菌屬（Acinetobactersp.）、3株為假單胞菌屬（Pseudomonassp.）、1株為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株PB-9的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain PB-9 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 巨大芽孢桿菌PB-9的解鉀條件優化

2.3.1 解鉀條件優化單因素試驗結果

由圖3可知，可溶性鉀含量隨著發酵溫度的升高呈先增大后減小的趨勢，當發酵溫度為31 ℃時，可溶性鉀含量（36.28 mg/L）最大，表明31 ℃是菌株PB-9解鉀的最適溫度。原因可能是溫度會影響菌株PB-9細胞內酶的活性，溫度31 ℃時菌株PB-9細胞內酶活性最高，所以菌株解鉀能力最強。可溶性鉀含量隨著初始pH值的升高呈先增大后減小的趨勢，當初始pH值為6.0時，可溶性鉀含量（33.16 mg/L）最大，表明初始pH值6.0是菌株PB-9解鉀的最適初始pH值。原因可能是環境中的pH值會影響菌株細胞內的pH值，菌株細胞內的pH值也會影響酶的催化活性，從而影響菌株的解鉀能力。可溶性鉀含量隨著接種量的增大呈先增大后減小的趨勢，當接種量為7.0%時，可溶性鉀含量（36.19 mg/L）最大，表明菌株PB-9解鉀的最佳接種量為7.0%。原因可能是當接種量過小時，達到最大解鉀能力需要時間較長，當接種量較大時，菌種之間形成競爭過于激烈，同樣不利于解鉀。可溶性鉀含量隨著發酵時間的延長呈先增大后減小的趨勢，當發酵時間為55 h時，可溶性鉀含量（36.16 mg/L）最大，這與菌種本身的遺傳特性及培養基豐富程度等因素有關。

圖3 不同培養條件對菌株PB-9解鉀能力的影響Fig.3 Effect of different culture conditions on potassium-solubilizing ability of strain PB-9

2.3.2 解鉀條件優化響應面試驗結果

根據單因素試驗結果，以發酵溫度（X1）、初始pH值（X2）、接種量（X3）和發酵時間（X4）為自變量，以可溶性鉀含量（Y）為響應值，進行中心組合響應面試驗，響應面試驗結果與分析見表5，方差分析見表6。

表5 菌株PB-9解鉀條件優化響應面試驗結果與分析Table 5 Results and analysis of response surface tests for potassium-dissolving conditions optimization

對表6結果進行多元回歸擬合，得到的回歸方程如下：

表6 響應面試驗結果方差分析Table 6 Variance analysis of response surface test results

由表7可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明模型可靠。一次項及二次項均對結果影響極顯著（P＜0.01），交互項對結果影響不顯著（P＞0.05）。對以上回歸方程求解可得出：X1=30.86、X2=6.76、X3=6.58、X4=52.61。也就是當發酵溫度為30.86 ℃、初始pH值為6.76、接種量為6.58%和發酵時間為52.61 h，可溶性鉀含量最高。結合實際情況，最終確定最優的發酵條件為發酵溫度31 ℃、初始pH值6.8、接種量6.6%和發酵時間53 h，可溶性鉀含量理論值36.28 mg/L，增長率136.24%。

為了檢驗模型的準確性，在最優條件下進行驗證試驗，結果可溶性鉀含量實際值為38.46 mg/L，與理論值相差較小。由此可以看出預測模型可以很好預測菌株PB-9實際發酵情況。

2.4 盆栽試驗結果

盆內種植牛蒡，一組盆內接種PB-9菌液，另一組為等量清水（CK）。30 d后測定牛蒡的生長參數，結果見表7。

表7 菌株PB-9對牛蒡生長的影響Table 7 Effect of strain PB-9 on the growth of burdock

由表7可知，與對照（CK）組相比，牛蒡生長的各項參數除了莖直徑差異不顯著（P＞0.05）外，其他各項指標都有顯著差異（P＜0.05）。接菌組牛蒡的株高、葉片數、地上部分鮮質量比CK組分別高25.78%、28.48%、26.54%。所以，菌株PB-9可以明顯的促進牛蒡的生長。原因主要是菌株PB-9除了具有較強的解鉀作用，還可以分泌IAA，并且能降低土壤pH值抑制有害微生物生長和提高土壤中可溶性鉀的含量。

3 結論

本研究從徐州豐縣牛蒡種植標準區牛蒡土壤中初篩出具有較強解鉀能力微生物9株，通過測定發酵液中可溶性鉀含量及IAA生產能力，復篩選出1株解鉀能力和產IAA能力都是最強的菌株PB-9。利用形態觀察、生理生化特性測定和16S rDNA基因序列分析，鑒定菌株PB-9為巨大芽孢桿菌（Bacillus megateriums）。通過單因素試驗和響應面試驗確定菌株PB-9的最優解鉀條件為培養溫度31 ℃、初始pH值6.8、接種量6.6%和培養時間為53 h，在此最優條件下，可溶性鉀含量為38.46mg/L，增長率為136.24%。最后，通過牛蒡盆栽試驗驗證菌株PB-9促生能力，結果顯示接菌組牛蒡的株高、葉片數和地上部分鮮質量比CK組分別高25.78%、28.48%、26.54%，對牛蒡的生長具有顯著的促進作用（P＜0.05）。