以腌漬辣椒水作為發酵劑發酵干辣椒的微生物篩選

陳 怡，方 俊，覃業優，蔣立文，劉 洋，李 跑，廖盧艷，王蓉蓉，周 輝

（1.湖南農業大學 食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.湖南壇壇香食品科技有限公司，湖南 長沙 410000）

辣椒含有豐富的維生素C[1]，具有預防心血管疾病、改善消化功能、減肥和促進血液循環等功效[2-6]。辣椒加工產品豐富，如辣椒醬、剁辣椒、鹽漬辣椒等[7-8]，因其獨特的發酵風味和營養價值而深受人們喜愛。其中，剁辣椒是湖南的特色發酵食品，也是湘菜的主要調味品之一，將新鮮辣椒清洗后剁碎，高鹽腌制、儲存，需要時再經脫鹽調味等加工處理后得到的加工產品即為剁辣椒[9]。剁辣椒生產一般是通過自然發酵制成，主要的微生物來源辣椒本身，一般發酵時間為30 d左右[10]，因此發酵較為緩慢；此外，剁辣椒加工方式以傳統作坊式加工為主，工器具和環境中的微生物侵入則可能導致質量問題。

在自然發酵的剁辣椒中，魏斯氏菌、明串珠菌和乳桿菌是主要的細菌菌屬，其中占細菌比例最大的是乳桿菌[12]，魏斯氏菌則被認為在發酵前期起主要作用。目前，為了適應剁辣椒工業化轉型的需求，針對剁辣椒的微生物領域研究主要集中在菌種選育、純種發酵、強化發酵等方面，謝靚等[13]通過接種耐鹽植物乳桿菌對不同鹽漬程度發酵辣椒揮發性成分的研究發現，接種耐鹽植物乳桿菌后揮發物質種類、相對含量明顯增多，有助于鹽漬辣椒香味物質形成。李文青等[14]將腸膜明串珠菌、植物乳桿菌、發酵乳桿菌和嗜酸乳桿菌按照1∶1∶1∶1的配方強化發酵辣椒，最終獲得優質剁辣椒。獲得風味良好的發酵辣椒則與篩選出適宜其發酵的菌株關系密切，王雪雅等[15]通過對10株乳酸菌進行產酸性、抑菌性等性能的篩選，研究表明發酵乳桿菌和食果糖乳桿菌是辣椒發酵過程中綜合品質較好的發酵優良菌株。鄧放明等[16]研究發現，Lact.chili6和Lact.chili8在低鹽發酵過程中具有良好的菌群優勢。

剁辣椒生產過程中存在大量的辣椒汁副產物，經過研究發現，辣椒汁具有獨特的風味和營養物質[18-20]。目前，大多數企業都把鹽漬辣椒汁作為污水排放，這不僅造成大量營養物質流失，還將對環境造成污染。因此，開發利用辣椒汁，提高其附加價值的同時亦能減少污染，具有良好的經濟意義和環保價值。本試驗選取5株菌株（凝結芽孢桿菌1.3220、植物乳桿菌1.555、植物乳桿菌1.3919、魯氏接合酵母2.1913、魯氏接合酵母2.371）為原始菌株，通過測定其產酸能力以及利用全自動微生物生長曲線分析儀對其在正常環境和不同鹽度環境下的生長情況進行檢測，篩選出的優勢菌株接入鹽漬辣椒汁作為腌制劑的干辣椒進行發酵，旨在篩選出合適的發酵菌株，設計出風味優良的產品，并為鹽漬辣椒汁的利用提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

16%鹽漬辣椒水、干辣椒：長沙壇壇香調料食品有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉：國藥集團化學試劑有限公司；酚酞：天津市化學試劑研究所有限公司；MRS肉湯培養基、營養肉湯培養基、麥芽汁培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司。其余試劑均為分析純。

凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）1.3220；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）1.555、1.3919；魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）2.1913、2.371：均來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器與設備

CP114 電子天平：奧豪斯儀器有限公司；KQ3200E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FE20K pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；20133419 超純水機：貝徠美生物科技有限公司；RTS生長曲線測定儀：浙江BIOSAN生物技術股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株生長規律的測定

表1 菌株生長曲線測定詳情Table 1 Growth curve determination details of strains

按照表1測定條件，從各斜面挑菌接入對應液體培養基進行不同條件下的菌株活化后，再次分別接入3%菌液于對應的液體培養基中，用RTS生長曲線測定儀每隔30 min測定一次。

1.3.2 試驗菌種產酸性能測定

根據表1中菌株活化后，分別取3%菌液接入對應液體培養基，除凝結芽孢桿菌在30 ℃恒溫培養箱培養以外，植物乳桿菌和魯氏接合酵母均在28 ℃恒溫培養箱中培養，共培養48 h，期間每4 h測一次酸度。酸度的檢測按照國標GB 5009.239—2016《食品中酸度的測定》[21]。

1.3.3 試驗菌種耐鹽性試驗

各試驗菌種按表1中的活化方法制作好后，分別取3%的菌液放入鹽度6%、8%、10%的培養基中混勻，以不加鹽作為對照（P-KB），用RTS生長曲線測定儀進行測定生長規律和產酸能力。

1.3.4 辣椒發酵樣品制備工藝流程及操作要點

將鹽度為16%的漬辣椒水用無菌蒸餾水稀釋至鹽度為10%后，作為干辣椒發酵劑。干辣椒粉碎成為片狀后按3∶1比例將鹽漬辣椒水和干辣椒混合均勻，再按3%接種量接入單一的菌種（對數生長期菌種，細胞濃度控制在108CFU/mL采用不接種進行對照）分別裝于滅菌好的5 L容量的白色食品桶中在30 ℃條件下密封發酵一個月。

2 結果與分析

2.1 試驗菌種生長規律測定結果

凝結芽孢桿菌1.3220、魯氏結合酵母（2.371、2.1913）和植物乳桿菌（1.555、1.3919）在相同環境下的生長曲線見圖1。由圖1可知，凝結芽孢桿菌1.3220在5～10 h 期間處于生長對數期階段，OD850nm值由0.51升至1.59，在10～60 h 階段處于生長穩定期，在60 h時OD850nm值達到整個生長過程的最高值2.5，之后則進入衰亡期。

圖1 不同菌株的生長曲線Fig.1 Growth curves of different strains

植物乳桿菌1.3919在16～32 h期間處于穩定生長期，在32 h之后，該菌則進入衰亡期。1.555的對數生長期處在8～14 h，直至33 h，OD850nm值達到最高為2.8，之后則進入衰亡期。植物乳桿菌1.555較1.3919的對數生長期長2 h，而穩定期短2 h，菌株1.3919的最大OD850nm值要較菌株1.555高0.6，說明植物乳桿菌1.3919在生長速率和后期發酵強度上要更優于1.555。

魯氏接合酵母菌2.1913的對數生長期是5～26 h，在35 h時最終達到最大OD850nm值為2.8，發酵40 h后，進入衰亡期。而2.371的OD850nm值在5～26 h上升速度較快，OD850nm值在50 h時達到最大為3.4，60 h后處于衰亡期。可知兩株魯氏接合酵母菌中，2.371的OD850nm值比2.1913高0.8，且衰亡時間比2.1913要晚20 h出現，說明2.371較2.1913可能更適于發酵。

2.2 試驗菌種產酸性能測定結果

5株菌生長期間產酸能力的對比結果見圖2。由圖2可知，同類型的菌株產酸能力相似，且植物乳桿菌的產酸能力明顯高于魯氏接合酵母，而凝結芽孢桿菌1.3220則幾乎不產酸。菌株1.3919在16～24 h的產酸能力最強，隨后上升酸度緩慢并在28 h時達到最高值1.98%，其次為菌株1.555在16～32 h期間酸度上升較快，且在32 h時酸度達到最大值1.8%。菌株2.1913與2.371的酸度變化趨勢相似，均在28 h時達到最大酸度值，分別為0.76%、0.65%，且明顯弱于植物乳桿菌。而所有菌中產酸能力最弱的則是凝結芽孢桿菌1.3220，在生長期間幾乎沒有酸度的變化。同時，鹽漬辣椒汁的鹽度一般在16%～17%，而最后產品脫鹽后廢棄的辣椒汁鹽度在8%～10%左右，為了進一步研究菌株投入發酵的實用性，對所有菌株的耐鹽性進行了研究。

圖2 不同菌株生長期間的酸度變化Fig.2 Changes in acidity during growth of different strains

2.3 試驗菌種不同鹽度下生長情況差異性比較

分別將不同菌株放置于調配成6%、8%、10%的鹽度的對應液體培養基中培養，通過RTS生長曲線測試儀測試菌株的生長曲線，以了解其耐鹽能力。

2.3.1 凝結芽孢桿菌1.3220在不同食鹽濃度中生長情況比較

菌株1.3220在3種不同鹽度的營養肉湯培養基中生長曲線的對比情況見圖3。由圖3可知，菌株1.3220在不同鹽度的環境下的生長趨勢較為相似，適應期均為0～8 h，且對數期均從8 h開始。隨著鹽度的增高，對數期結束時間隨之延長，6%、8%、10%鹽度下對數期時長分別為12 h、13 h、14 h。3種鹽度下菌株1.3220的穩定期生長曲線呈相對平行的狀態，穩定期時長分別為31 h、32 h、34 h，此外此菌在10%的鹽度條件下，在22 h時達到最大OD850nm值（2.53）。綜上可得，菌株1.3220在3種不同鹽度下的生長曲線較為相似，各最大OD850nm值差距較小，任何鹽度環境條件下的生長較正常情況下均更好，說明其菌密度情況相近，也表明此菌耐鹽能力較強，且生長較穩定。

圖3 凝結芽孢桿菌1.3220在不同鹽度中生長曲線變化Fig.3 Growth curve change of Bacillus coagulans 1.3220 in different salinities

2.3.2 植物乳桿菌在不同食鹽濃度中生長情況比較

圖4 菌株1.3919（a）和1.555（b）在不同鹽度中的生長曲線Fig.4 Growth curves in different salinities of strain 1.3919 (a) and 1.555 (b)

由圖4（a）可知，1.3919隨著生長環境的鹽度增加，適應期有所延長，6%鹽度條件下適應期為8 h，而10%鹽度條件下則延長至12 h。6%、8%、10%鹽度環境下此菌的對數生長期分別為8～22 h、12～32 h、12～90 h，其中6%、8%鹽度條件下菌的生長曲線上升速率較快，而鹽度為10%時則較緩。隨著鹽度的升高，可達到的OD850nm值也越大，分別為3.85（6%）、5.18（8%）、5.41（10%），均高于圖2（a）中最高OD850nm值（3.4）。由圖4（b）可知，隨著環境鹽度的增加，植物乳桿菌1.555與1.3919的對數生長期與最大OD850nm值也隨之增加，6%、8%、10%鹽度條件下最大OD850nm值分別為3.18（64 h）、5.19（60 h）、5.42（96 h），均高于圖1的最高OD850nm值（2.8）。

由此可得兩種植物乳桿菌在低鹽環境下的生長情況均優于其在普通環境中生長，說明非常適合利用于鹽漬等發酵產品。此外，雖然兩種植物乳桿菌在10%鹽度條件下菌密度相差較小，但菌株1.555的適應期較菌株1.3919長5 h，表明1.3919更加耐鹽，在實際發酵中能夠更快的適應發酵環境。

2.3.2 魯氏接合酵母在不同食鹽濃度中生長情況比較

圖5 菌株2.1913（a）和2.371（b）在不同鹽度中的生長曲線Fig.5 Growth curves in different salinities ofstrain 2.1913 (a) and 2.371 (b)

由圖5（a）可知，菌株2.1913在不同鹽度下，適應期均為0～20 h左右，但隨著鹽度增加其對數增長期時長也增加，分別為35 h（6%）、40 h（8%）、77 h（10%），其中8%條件下，增長速率最大，此菌的平穩期時長較短，平均在10 h左右，隨后開始進入衰亡期。3種鹽度下最大OD850nm值相差較大，10%鹽度條件下菌群雖增長速率稍低，但對數增長時期最長，98 h時OD850nm值為最高（5.4），而6%條件下最低（3.38）。

由圖5（b）可知，菌株2.371的3條生長曲線差距較大，說明此菌的生長情況受環境鹽度影響較大，10%鹽度環境下在0～70 h期間的OD850nm值均低于其他2種鹽度，但期菌體增長時間持續至100 h，較6%、8%鹽度情況下分別長52 h、44 h，且在100 h時達到最高OD850nm值（5.4），可知雖然較高的鹽度對2.371前期的生長造成了一定程度的抑制，但也延長了該菌的對數生長期時間。

結果表明，魯氏接合酵母2.1913、2.371均在10%鹽度中生長最佳，且2株菌的生長最旺盛時的菌密度一致，但菌株2.371的對數、穩定生長期都長于2.1913，說明菌株2.371更適合利用于長時間發酵產品。此外，植物乳桿菌1.3919較1.555更加具有耐鹽性，在實際發酵中能夠更快的適應發酵環境。而凝結芽孢桿菌1.3220的耐鹽能力以及產酸能力均要明顯低于其他菌株，因此選用植物乳桿菌1.3919與魯氏接合酵母2.371對辣椒汁進行發酵。

2.4 菌株1.3919與2.371接入辣椒醬發酵過程中酸度變化

綜上所述，將單株微生物接入以鹽漬辣椒汁作為發酵劑來發酵干辣椒后，通過檢測其生長曲線的情況，篩選出兩株優良菌株，分別為植物乳桿菌1.3919與魯氏接合酵母2.371。為了解發酵過程中酸度的變化，則對菌株2.371菌株1.3919在整個發酵過程（30 d）中，每間隔5 d檢測一次酸度情況，并且與未接菌樣品P-KB進行比較，結果見圖6。

圖6 接入不同菌種后辣椒發酵過程中的酸度變化Fig.6 Changes of acidity in pepper fermentation process after inserting different strains

由圖6可知，隨著發酵時間的延長，未接菌辣椒汁的酸度也有一定程度的增加，這是因為辣椒發酵本身所帶有的菌如乳酸桿菌、明串珠菌等具有一定產酸能力[11]；而植物乳桿菌1.3919與魯氏接合酵母2.371發酵辣椒汁時酸度均呈先上升后下降的趨勢，并在15 d達最高值，分別為1.23%、1.03%。發酵結束時（30 d）植物乳桿菌1.3919菌的酸度為1.23%，較未接菌發酵辣椒汁（P-KB）高0.78%。說明，植物乳桿菌1.3919產酸能力更強，與前期實驗（圖2）結果一致。

3 結論

為篩選出適合接種于鹽漬發酵辣椒中的菌株，該研究測定了2株植物乳桿菌（1.3919、1.555）、2株產香魯氏接合酵母菌（2.1913、2.371）和1株凝結芽孢桿菌1.3220的生長曲線、產酸能力及耐鹽性，并利用優勢菌株對剁辣椒副產物辣椒汁進行發酵。結果表明：在正常環境下，菌株1.3220對數增長期最短且最快進入平穩期，菌株1.3919的生長繁殖能力最強且最快，OD850nm值在25 h達到最大為3.4；同類型的菌株產酸能力相似，植物乳桿菌中1.3919產酸能力最強（1.98%），其次為魯氏接合酵母2.1913，而凝結芽孢桿菌1.3220則幾乎不產酸。此外，5種菌在含鹽條件下的OD850nm值均大于其正常情況，且在10%鹽度條件下生長情況最佳。說明這5種菌有較好的耐鹽能力，其中魯氏接合酵母2.371及植物乳酸桿菌1.3919最好。因此將上述所選的兩株最佳菌株分別接入以廢棄鹽漬辣椒水為發酵劑的干辣椒中進行發酵發酵15 d后，各樣品酸度均達到最高值，其中以PL-1.3919最高（1.23%），比未接菌的提高了2.28倍，本研究分析了5株常見發酵菌株的產酸能力和耐鹽能力，并篩選兩株菌株對辣椒汁進行發酵，為辣椒強化發酵提供參考，但對于風味物質以及有機酸形成等的影響還有待研究。