枸杞酒多糖的提取、成分測定及其對酒精性肝病的影響研究

趙嘉慶，史春麗，王立英，何 斌，趙 巍，王 浩

（1.寧夏醫科大學 基礎醫學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏回族自治區醫學科學研究所，寧夏 銀川 750004；3.寧夏森淼枸杞科技開發有限公司，寧夏 銀川 750000）

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由持續過量飲酒引起的一種慢性、廣譜的肝臟損傷，在全世界酗酒人群中排在發病率和死亡率的主要原因之列[1]。ALD包括肝損傷的組織學范圍，從單純性脂肪變性到以炎癥為特征的肝炎，并有可能進展為纖維化和肝硬化。肝臟慢性炎癥在慢性飲酒者中的發病率約為10%～35%，在ALD的可逆病理過程中起重要作用，可導致超過1/3的發病率和死亡率[2-4]。當肝臟受到損傷時，丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）與天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）大量釋放到外周血中，其含量異常增高，肝臟組織中出現細胞壞死和及相關炎性細胞因子的產生，從而提示肝臟病變[5]，為減少酒精性肝病對人體造成的損傷，大量的研究者進行酒精肝的緩解與保護方面的研究，相關文獻報道顯示，琴葉榕[6]、草果，菱角殼水提混合物[7]、醋酸菊粉[8]等粗提物對酒精肝均具有一定的保護作用。

枸杞多糖具有抗細胞凋亡、抗氧化、抗炎和促進生育功能[9-10]外，對酒精肝的作用還不清楚，少有研究關于來源于枸杞酒類的多糖對酒精肝的作用。該研究主要以枸杞酒為研究對象，經過多重工藝進行加工提純，制成香醇可口的養生保健品，其主要為枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharides，LBP）。本研究通過建立經典的酒精肝病小鼠模型，并探究寧夏特色枸杞酒產品中枸杞多糖的主要成分，并驗證對酒精肝的保護作用，這有助于枸杞酒的開發和利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣本信息

枸杞酒（酒精度12%vol）及枸杞酒中提取的枸杞多糖：寧夏銀川森淼科技有限公司。

1.1.2 實驗動物與飼料

選用6～8周齡的60只雌性C57BL/6小鼠，體質量為28～30 g，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司。適應性喂養1周后按體質量隨機分為4組，每組15只，分別為對照組、模型組、對照＋LBP組、模型＋LBP組。飼養于溫度在20～26 ℃，相對濕度在45%～75%的SPF動物房內。

飼料：模型組飼喂能量組成為蛋白質18%、碳水化合物19%、脂肪35%、乙醇28%的改良酒精玉米油液體日糧，對照組飼喂等熱量麥芽糖糊精的改良玉米油液體日糧作為對照，均購買于中國南通營養動物飼料高科技有限公司。

1.1.3 試劑

硝酸、鹽酸、體積分數為95%乙醇（分析純）、多元素混合標準儲備液、氨基酸標準儲備液；丙酮溶液70%、雷氏鹽3%；血清內毒素檢測試劑盒（鱟試劑）：廈門生物多科技有限公司；IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10細胞因子檢測試劑盒：廈門生物多科技有限公司；胎牛血清、磷酸鹽緩沖液：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TS-NS-300中試水提醇沉設備：上海順儀實驗設備有限公司；AU400全自動生化分析儀：710-ES電感耦合等離子體發射光譜儀：美國瓦里安公司；TU-1900紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；日本奧林巴斯公司；C6流式細胞分析儀：美國BD公司；Z326K臺式冷凍離心機：德國Hermle公司；GYXH-70制冰機：廈門國儀科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞酒多糖提取及制備

以釀制的酒精度為12%vol枸杞酒為原料，每次1000mL，進行旋蒸濃縮，全部濃縮完成后合并濃縮液，用體積分數為95%乙醇調至乙醇終體積分數80%后，沉淀過夜，傾出上清液后，冷凍干燥即得。

1.3.2 枸杞酒中枸杞多糖含量的測定

準確稱取105 ℃干燥質量恒定的分析純無水葡萄糖0.1 g，加水溶解并定容至1 000 mL。準確吸取溶液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、2.0 mL，分別置于具塞試管中，各加水使體積為2.0 mL，再各加6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后放置5 min，置沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫；另取水2 mL加6%苯酚溶液和濃硫酸，同上操作，作為空白對照，于490 nm波長處測定吸光度，繪制葡萄糖標準曲線。分別吸取0.01 mL枸杞酒樣品，再分別加入超純水1.99 mL，混勻。

1.3.3 枸杞酒多糖中礦質元素含量檢測

稱取制備好的枸杞酒多糖0.1 g置于50 mL消解管中，加入10 mL硝酸，利用石墨消解爐加熱至180 ℃消解，當溶液消解至無色透明狀后，繼續趕酸，剩余1～2 mL停止消解，轉移至10 mL樣品管中，使用超純水定容，上機檢測[11]。

1.3.4 枸杞酒多糖中氨基酸含量測定

稱取制備好的枸杞酒多糖0.1 g，置于厭氧管中，加入10 mL濃度為6 mol/L的鹽酸溶液，置于110 ℃烘箱中，水解反應24 h，水解結束后，放至室溫，過濾，吸取0.5 mL濾液置于試管濃縮儀中，濃縮蒸發至干，加入2 mL樣本稀釋液，震蕩混勻，用0.22 μm水性濾膜過濾后，上機檢測。

1.3.5 實驗動物處理方法

根據現有文獻報道[12]的方法，進行酒精肝模型的制備。一種簡單的酒精性肝脂肪變性小鼠模型是通過長期酒精喂養加一次大量酒精攝入后誘導而成[13]。模型+LBP與對照+LBP兩組每只鼠每日分別進行枸杞酒多糖150 mg/kg長達6周的灌胃，模型與對照組小鼠灌服等量的生理鹽水后，所有小鼠口服對照液體飼料一周，然后給予含有乙醇的改良液體飼料（模型組）或等熱量麥芽糖糊精作為對照（對照組），為期10 d，第11天，單次灌胃31.5%乙醇（5 g/kg）或等熱量麥芽糖糊精溶液。對照組和對照+LBP組分別為模型組和模型+LBP組的配對喂養對照。根據制造商的說明，每天都有新鮮的粉末制成流質日糧，監測并計算飲酒小鼠的攝食量和平均每天每只小鼠的攝食量。計算出的體積被用來調整給予配對喂養的小鼠的對照液體飲食量，以便酒精喂養的小鼠和配對喂養的小鼠攝入等量的食物。第12天，安樂處死小鼠，觀察相關指標。

1.3.6 生化指標檢測

取小鼠外周血于1.5 mL離心管中，2 000 r/min，4 ℃離心10 min，分離出血清。寧夏醫科大學科技中心醫學分析檢測中心檢測血清中丙氨酸氨基轉移酶（ALT）與天冬氨酸氨基轉移酶（AST）的含量。

1.3.7 血清內毒素含量檢測

血清內毒素的含量采用廈門科技有限公司血清內毒素檢測試劑盒檢測，操作步驟詳見說明書。

1.3.8 脾臟與血清酶聯免疫吸附實驗

取0.5 g肝組織勻清于1.5 mL冰冷50 mol/L Tris緩沖液（pH 7.2，Tris含1%Triton-X100和0.1%蛋白酶抑制劑）中，冰上振蕩90 min。取勻清，3 000 g離心15 min。收集上清液測定腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）濃度。采用酶聯免疫吸附實驗檢測血清和肝組織上清液中各細胞因子水平，按操作說明書進行。

1.3.9 統計學分析

使用Graphpad Prism 6.0軟件進行統計學分析，各組實驗數據用表示，兩組間比較用兩樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 枸杞酒多糖的提取

葡萄糖的標準曲線回歸方程為：y=36.47x+0.025 3，相關系數為R=0.998 6。以枸杞酒為原材料，提取枸杞多糖其多糖質量濃度為1.2 g/L。

2.2 枸杞酒多糖成分的測定

2.2.1 枸杞酒多糖中礦質元素含量測定

對枸杞酒多糖中礦物質元素含量的檢測，含量測定結果見表1。由表1可知，枸杞酒多糖中礦物質元素種類和含量較為豐富，其中常量元素Ca、P、Mg、K、Na的含量較高，分別為0.09%，0.68%，0.27%，3.92%，0.51%。這些常量元素是維持人機體代謝的重要物質，缺少任何一種都會使人體代謝出現失調[14]。枸杞多糖中含量前三的微量元素有Fe、Zn、Cu，其含量分別為0.007 8%，0.005 3%，0.002 5%。微量元素能與氨基酸、蛋白質或其它有機結合形成各種酶、激素、核酸、維生素等具有生物活性和催化生物反應的作用。這些礦物質元素含量明顯高于趙麗莉等[15]通過微波密閉消解法測定寧夏枸杞中礦物元素中的元素含量，說明枸杞酒多糖中含有較高的礦物質元素，這可能對人體的代謝具有一定的促進作用。

表1 枸杞葉多糖中礦質元素含量檢測結果Table 1 Determination results of mineral elements in polysaccharides of Lycium barbarum wine

2.2.2 枸杞酒多糖中氨基酸含量測定

氨基酸對人體的代謝組成發揮著重要作用。氨基酸是組成蛋白質的基本單位，能夠維持人體的正常代謝，是體內的酶、激素、抗體的重要組成成分，具有延年益壽，增加免疫力的功效。而枸杞多糖能夠增加機體免疫力，這與其中含有多種氨基酸是分不開的。對枸杞酒多糖中氨基酸含量進行檢測，結果見表2。由表2可知，枸杞酒多糖中共檢測到17種氨基酸，其中以天冬氨酸（ASP）、谷氨酸（GLU）、脯氨酸（PRO）的含量較多，分別為7.25%、4.96%、3.56%，其次為絲氨酸（SER）、丙氨酸（ALA）、精氨酸（ARG），含量分別為1.87%、1.74%、1.24%。蘇氨酸（THR）、組氨酸（HIS）、賴氨酸（LYS）、纈氨酸（VAL）、亮氨酸（LEU）含量分別為0.86%，0.34%，0.33%，0.30%，0.30%。

表2 枸杞酒多糖中氨基酸含量測定結果Table 2 Determination results of amino acids in polysaccharides of Lycium barbarum wine

2.3 枸杞酒多糖對酒精性肝病的影響

2.3.1 小鼠血清中ALT、AST及LPS水平

慢性飲酒后血清丙氯酸氨基轉移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平異常增高，提示肝臟受到損傷[16-18]。不同處理組對小鼠血清中ALT以及AST水平的影響結果見圖1。由圖1可知，模型組血清ALT和AST水平顯著升高（P＜0.001），可判定酒精肝造模成功。模型+LBP組小鼠血清ALT、AST明顯降低（P＜0.001），具有統計學差異。提示LBP得干預可減輕慢性酒精喂養所致的肝損傷。就相關文獻報道，LBP也可通過降低其他炎癥性疾病的ALT和AST水平來減輕肝臟損傷的能力[19-20]。

圖1 不同處理組對小鼠血清中血清谷丙氨酸氨基轉移酶與天冬氨酸氨基轉移酶水平的影響Fig.1 Effects of different treatment groups on the level of alanine amino transferase and aspartate amino transferase in mice plasma

圖2 不同處理組對小鼠血清中脂多糖水平的影響Fig.2 Effects of different treatment groups on the level of lipopolysaccharide in mice plasma

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是ALD肝臟炎癥的觸發因子，通過門靜脈移位到肝臟，與抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）的TLR-4結合，誘導炎癥免疫反應，最終導致慢性肝炎[21]。不同處理組對小鼠血清中LPS水平的影響結果見圖2，結果顯示，與模型組相比，模型+LBP組血清內毒素水平顯著降低（P＜0.000 1），但仍高于對照組和對照+LBP組，說明膳食LBP具有降低血液循環內毒素血癥的作用，降低ALD大鼠腸道通透性，減少LPS從腸道向肝臟的移位，減少ALD的系統循環，從而減輕肝臟的炎癥反應。這種減弱可能與腸道天然免疫系統有關，其潛在機制需要進一步研究[22]。

2.3.2 小鼠血清及肝臟中細胞因子水平。

圖3 不同處理組對小鼠血清和肝臟細胞因子水平的影響Fig.3 Effects of different treatment groups on the levels of cytokines in plasma and liver of mice

庫普弗細胞和中性粒細胞是ALD引起炎癥的主要細胞，其誘導氧化應激，并產生炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細胞介素-6（IL-6），導致肝細胞凋亡和壞死，從而導致肝損傷[23-24]。不同處理組對小鼠血清和肝臟細胞因子水平的影響結果見圖3。由圖3可知，慢性酒精攝入后，空白組血清和肝臟IL-1β、IL-6和TNF-α較上述細胞因子顯著升高（P＜0.05），然而經過LBP干預后的模型鼠降低乙醇引起的血清和肝臟IL-1β異常升高（P＜0.05），具有統計學差異。同樣，模型+LBP組血清和肝臟IL-6和TNF-α水平也明顯低于這兩種細胞因子（P＜0.000 1）。模型組與模型+LBP組血清和肝臟IL-10水平無顯著性差異（P＞0.05）。表明經LBP治療后，循環和肝臟炎癥明顯減輕，提示LBP對ALD的保護作用可能與其抗炎作用有關。

3 結論

從枸杞酒中提取出多糖，并對其成分進行了測定，發現了大量的氨基酸及礦物質元素，從而進一步證實了枸杞多糖是枸杞酒發揮養生保健作用的重要因素，并且長期飲食枸杞多糖的酒精肝小鼠，血清中ALT、AST及LPS含量較酒精肝模型組明顯降低，炎癥因子也顯著下降。可見LBP的干預可緩解酒精性肝損傷，提示在日常飲酒的過程中，含有枸杞多糖的枸杞酒可以在一定程度上減輕酒精對人體造成的傷害，這對寧夏枸杞酒的開發利用提供了一定的理論基礎與應用價值。但是來源于枸杞酒中的枸杞多糖具體的酸堿度及活性成分分析及對酒精肝發揮作用的具體機制還需進一步研究。