蘋果酵素自然發酵工藝優化及品質分析

張海燕，康三江*，袁 晶，曾朝珍

（1.甘肅省農業科學院 農產品貯藏加工研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省果蔬貯藏加工技術創新中心，甘肅 蘭州 730070）

食用植物酵素是指以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經微生物發酵制得的含有特定生物活性成分可供人來食用的酵素產品[1-2]。其在含有植物本身的多種維生素、酶和礦物質等營養物質的同時，還通過微生物發酵產生新的次生代謝物及活性成分，與直接食用蔬菜水果相比，酵素中的生物活性成分和有機小分子更為濃縮，而且更容易為人體所吸收，這正是酵素的魅力所在，也是研究熱點。大量研究表明，這些物質從細胞層面調節機體的生命活動，具有抗氧化[3-5]、降血脂及減肥[6-7]、提高免疫力[8-9]、解酒與護肝[10]、抑菌[11]、改善腸胃功能[12-13]等功效。但是，由于目前許多酵素的生產工藝不規范，發酵過程控制不科學，使得產品中代謝物的代謝通路以及代謝終產物難以確定，同時各類酵素產品成分復雜，作用機理尚不明確。因此，食用酵素的生產工藝以及產品質量控制都有待進一步的發展與研究。

蘋果因其優良的感官特性和糖類、蛋白質、有機酸、維生素及蘋果多酚等豐富的營養成分而成為全球最受歡迎的水果之一[14]，具有抗氧化、延緩衰老和增強免疫力等功效[15]。目前，蘋果對健康的影響主要歸因于其酚類化合物含量高，酚類物質在抑制腫瘤、防止冠心病等方面具有很高的生理活性[16]。自然發酵體系是酵素食品開發應用的基礎和微生物多樣性研究的重要來源[17]，該技術作為酵素產品制作工藝的重要環節之一，可產生多種酶、短鏈脂肪酸、醇、酯等次級代謝產物，亦可能將原料的某些成分轉化成高活性物質，因而產品的風味比較特殊[18]。以蘋果為原料，經天然發酵的蘋果酵素的抗氧化活性和代謝產物均有提高[19-20]，崔國庭等[21]采用響應面分析法優化了蘋果酵素純種發酵工藝，同時對其體外抗氧化活性和酶活性的變化進行了分析，但有關蘋果酵素自然發酵工藝及品質變化的研究尚未見報道。因此該研究以蘋果為原料，以pH值、可溶性固形物、總酸、感官評價、還原力、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和酚類物質等指標為衡量標準，探究蘋果酵素品質變化，并通過響應面法優化蘋果酵素自然發酵工藝，以期為蘋果酵素產品質量控制和指導生產實踐提供部分理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富士蘋果（長富2號）：采自甘肅省慶陽市有機蘋果基地；果糖：市售；純凈水：本實驗室自制；三羥甲基氨基甲烷：上海源葉生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、鹽酸、氫氧化鈉、酚酞、乙醇、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、Tris、甲醇和乙腈等（均為色譜純）：中瑞化學試劑公司；蘆丁、槲皮素-半乳糖苷、槲皮素-葡萄糖苷、槲皮素-木糖苷、槲皮素-呋喃阿拉伯糖苷、鼠李糖苷、槲皮素-吡喃阿拉伯糖苷、根皮苷、綠原酸、隱綠原酸、原花青素B1、原花青素B2、原花青素C1、兒茶素、表兒茶素標準品（純度＞98%）：美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設備

Waters Xevo TQ-S IVD超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜系統，配置Acquity PDAeλ二極管陣列檢測器、Waters ACQUITY UPLC?HSST3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）：Waters上海科技有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計：上海凌析達儀器有限公司；LRH-70 型恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；YXQ-LS-75G 型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DK-S24 數顯恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；MIRCOCL 17R離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；超低溫冰箱：青島海爾集團；DL-CJ-1N超凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；PB-10型精密pH計：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘋果酵素制備工藝流程及操作要點

蘋果原料選擇→清洗→去核→切分→裝罐→加水→調節糖度、pH→發酵→過濾→成品

操作要點：新鮮蘋果用純凈水沖洗干凈，瀝干水分后去核并切分成3～5 mm的片，冰糖破碎后用紫外燈輻照處理30 min，將蘋果片與純凈水的按設置好質量比加入無菌酵素發酵罐中，根據設置好的糖添加量加入冰糖調節糖度，用檸檬酸和NaOH調節，置于陰涼干燥的發酵車間，在常溫（20～26 ℃）條件下自然發酵3個月，發酵第一個月隔天攪拌通氣，之后密封發酵，發酵結束取上清液進行指標測定。

1.3.2 蘋果酵素自然發酵工藝優化

（1）發酵工藝對蘋果酵素品質的影響

分別考察初始pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、糖添加量（0、5%、10%、15%、20%）、蘋果片質量濃度（100 g/L、200 g/L、300 g/L、400 g/L、500 g/L）對蘋果酵素發酵過程中pH值、可溶性固形物、總酸、感官評價、還原力和超氧化物歧化酶（SOD）活性等指標的影響，確定發酵工藝對蘋果酵素品質的影響效果，并篩選適宜范圍進行響應面優化試驗，重復3次。

（2）響應面試驗設計

采用Box-Benhnken模型試驗設計原理[22]，以初始pH值、糖添加量、蘋果片質量濃度為自變量，以X1、X2、X3表示，并以+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平，以蘋果酵素產品的感官評價（Y1）和SOD活性（Y2）為響應值，進行3因素3水平響應面分析，試驗重復3次，優化蘋果酵素自然發酵工藝條件，響應面試驗因素水平編碼見表1。

表1 發酵工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermentation process optimization

1.3.3 理化指標

pH值的測定：采用pH計法測定；總酸的測定：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》方法；可溶性固形物含量的測定：采用糖度計法測定。

1.3.4 感官指標的測定

依據GB/T 16291.1—2012《感官分析選拔、培訓與管理評價員一般導則第1部分：優選評價員》要求，篩選出6名評價員組成感官評價小組，對其進行蘋果酵素的感官評價培訓，并根據QB/T 5323—2018《植物酵素》中食用植物酵素的規定對蘋果酵素的色澤、組織形態、滋味、氣味、雜質等應用9點標度法[23]進行感官評價，見表2。評價時采用3位數字隨機編碼保證樣品提供的一致性，以隨機的順序提供，評價小組3次重復后的平均分為指標定量結果（滿分9分）。

表2 蘋果酵素感官評價描述詞標度Table 2 Sensory attributes descriptors and intensity scale of apple enzyme

1.3.5 還原力測定

參照肖夢月等[24]的測定方法，有改動。取蘋果酵素發酵液0.2 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）和1.0 mL 10%的鐵氰化鉀溶液，于50 ℃水浴20 min后快速冷卻，再加入2.5 mL 20%的三氯乙酸溶液后，于3 600 r/min離心20 min后立即取上清液1.5 mL，加入去離子水1.5 mL和0.1%三氯化鐵0.5 mL。以去離子水作參比在波長700 nm處測定吸光度值（OD700nm值）。吸光度值越大，說明還原能力越強，抗氧化效果越好。重復3次，取平均值。

1.3.6 SOD活性的測定

參照GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶活性》。

1.3.7 酚類化合物的測定

采用超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）及液相色譜-質譜聯用技術（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）進行測定，參照李靜等[25]的方法。依次用5 mL甲醇和5 mL活化C18固相萃取小柱，倒入樣液，用5 mL超純水分2次淋洗固相萃取小柱，棄除淋洗液，再用4 mL甲醇分2次淋洗固相萃取小柱，收集淋洗液，最后用甲醇定容至5 mL，過0.22 μm有機相濾膜，待分析。質譜條件：離子源溫度為150 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，脫溶劑氣流量800 L/h，錐孔氣流速50 L/h。超高效液相色譜條件：柱溫為40 ℃，流速為0.3 mL/min，進樣量為2.0 μL，流動相A為乙腈，流動相B為0.5%的甲酸溶液，梯度洗脫，A液：0%（0 min）→10%（1 min）→25%（16 min）→40%（18 min）→100%（19 min），20 min回到初始狀態，平衡5 min。掃描波長參數設定為210～600 nm，通道為280 nm、320 nm和360 nm。

1.3.8 統計學處理

每組試驗重復3次，試驗數據采用Excel 2010、SPSS 22.0數據分析軟件進行分析處理及作圖，Box-Behnken設計采用Design Expert 8.0.6軟件并進行響應面分析，試驗結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 發酵工藝對蘋果酵素品質的影響

2.1.1 初始pH值對蘋果酵素品質的影響

pH值、可溶性固形物、總酸等是衡量酵素發酵成熟的主要指標，感官評價、還原力和SOD活性等也是反映酵素品質的重要指標。由圖1（A）可知，隨著初始pH值的升高，蘋果酵素產品的pH值和可溶性固形物均呈先降低后升高趨勢，pH 4.5時最低，分別為3.06和3.4°Bx，但對產品pH值的影響較小，在3.06～3.24之間；總酸含量則呈反向趨勢，先升高后降低，pH 4.5時達到峰值，為2.91 g/L。由圖1（B）可知，隨著初始pH值的升高，產品的感官評分、還原力以及SOD活性均呈先升高后降低的趨勢，pH 4.5時達到最大值分別為7.41分、2.14（OD700nm值）、41.53 U/mL，均高于pH 4.0和pH 5.0條件下發酵的。說明pH值過高或過低均會抑制微生物的生長以及酶的活性，進而影響pH值、可溶性固形物、總酸、感官評價、還原力以及SOD活性等指標的變化，pH 4.5的發酵環境適合蘋果酵素自然發酵微生物快速繁殖和生長代謝，有利于提高碳水化合物的利用率，使得發酵液中可溶性固形物降低，增強還原力和SOD活性，同時由于乳酸、乙酸、蘋果酸等有機酸含量增加，引起總酸含量增加，pH值降低。綜合選擇適宜的初始pH 4.0～5.0進行后續試驗。

圖1 初始pH值對蘋果酵素品質的影響Fig.1 Effect of initial pH on apple enzyme quality

2.1.2 糖添加量對蘋果酵素品質的影響

不同糖添加量對蘋果酵素品質的影響見圖2。由圖2（A）可知，發酵液中不添加糖時，蘋果酵素產品的pH值較高，為3.55，可溶性固形物和總酸含量均較低，分別為3.4°Bx和0.82 g/L，隨著糖添加量的增加，pH值呈先降低后升高的趨勢，糖添加量15%時最低，為3.03；可溶性固形物則隨著糖添加量的增加而逐漸升高；總酸的變化趨勢為先升高后降低，糖添加量15%時達到最大值3.24 g/L，高于糖添加量為10%和20%的。由圖2（B）可知，感官評分和SOD活性的變化在0～15%之間呈上升趨勢，其中在糖添加量為15%時達到最大分別為7.29分和33.12 U/mL，之后隨著糖添加量增加逐漸下降；而還原力則隨著糖添加量的增加而一致增大，與肖夢月等[24]的研究結果一致。說明發酵液中糖添加量過高或過低，都可能會嚴重影響微生物的生長和產物的合成，糖添加量過低，發酵不完全，pH值較高，產物少，總酸、感官評價、還原力和SOD活性等不高；糖添加量過高，發酵液的滲透壓增加，微生物正常生長代謝受到抑制，發酵進程不能順利進行，pH值下降受阻，總酸、感官評價、還原力和SOD活性等均受到影響。綜合選擇適宜的糖添加量10%～20%進行后續試驗。

圖2 糖添加量對蘋果酵素品質的影響Fig.2 Effect of sugar addition on apple enzyme quality

2.1.3 蘋果片添加量對蘋果酵素品質的影響

圖3 蘋果片含量對蘋果酵素品質的影響Fig.3 Effect of apple slices concentration on apple enzyme quality

由圖3（A）可知，蘋果片含量在100～200 g/L時，pH值、可溶性固形物呈下降趨勢，蘋果片含量在200 g/L時最低，分別為3.06和4.2°Bx，之后隨著蘋果片質量濃度的增加逐漸上升；而總酸的變化趨勢正好相反，在蘋果片含量為200 g/L時達到最大值3.99 g/L。由圖3（B）可知，感官評分、還原力和SOD活性均隨蘋果片含量的增加呈先升高后降低趨勢，當蘋果片含量為200 g/L時最高，分別為7.6分、2.18（OD700nm值）、32.28 U/mL。這可能是由于加水會降低發酵體系中的糖濃度而降低高滲透壓，并升高發酵液pH值，降低二者對微生物生長和發酵的影響，但只有在適宜的蘋果片質量濃度下蘋果酵素才能發酵完全，保證產品品質，繼續增加加水量，會使發酵體系中糖濃度過低，pH值過高，不利于發酵。綜合選擇適宜的蘋果片含量為100～300 g/L進行后續試驗。

2.2 蘋果酵素自然發酵工藝響應面優化試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計及結果

基于單因素試驗結果分析，選擇初始pH值、糖添加量、料液比為影響因素，以感官評價和SOD活性為響應值，對酵素自然發酵工藝條件進行3因素3水平的響應面分析，試驗設計及結果見表3。

表3 發酵工藝優化響應面試驗設計與結果Table 3 Design and results of response surface methodology for fermentation process optimization

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析

利用Design-Expert 8.0數據分析軟件對所得試驗數據進行多元回歸分析，得到感官評價（Y1）和SOD活性（Y2）對自變量初始pH值（X1）、糖添加量（X2）、蘋果片質量濃度（X3）的二次多項回歸模型方程分別為：

表4 以感官評分為評價指標回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model using sensory evaluation as evaluation index

對感官評價的回歸模型進行方差分析，結果見表4。由表4可知，回歸模型差異極顯著（P＜0.000 1），失擬項P值為0.892 2，無顯著性影響（P＞0.05），回歸方程的決定系數R2=0.994 2，調整決定系數R2Adj=0.986 8，說明該模型能夠解釋99.92%的變化，設計的預測值和試驗值相近，該模型對蘋果酵素自然發酵工藝優化試驗擬合程度較好。結果表明，X1、X2、X3、X1X3、X2X3、X12、X22、X32對蘋果酵素感官評價的影響均達到了極顯著水平（P＜0.01），X1X2對蘋果酵素感官評價的影響顯著（P＜0.05），各因素的影響依次為初始pH值（X1）＞糖添加量（X2）＞蘋果片質量濃度（X3）。

對SOD活性的回歸模型進行方差分析，結果見表5。結果見表5。回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項P值為0.556 7，影響不顯著（P＞0.05），回歸方程的決定系數R2=0.997 5，調整決定系數R2Adj=0.994 2，說明該模型能夠解釋99.93%的變化，預測值和試驗值之間有較好的相關性，該模型對蘋果酵素自然發酵工藝優化試驗擬合程度較好，可用該回歸方程預測蘋果酵素自然發酵工藝條件。結果表明，X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X2X3、X12、X22、X32在蘋果酵素自然發酵工藝優化中對SOD活性的影響極顯著（P＜0.01），各因素的影響依次為初始pH值（X1）＞糖添加量（X2）＞蘋果片含量（X3）。

表5 以超氧化物歧化酶活性為評價指標回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model using superoxide dismutase activity as evaluation index

2.2.3 最佳條件預測及驗證試驗

通過Design-Expert 8.0軟件進行最大值分析，蘋果酵素自然發酵對感官評價的最佳工藝條件為：初始pH值4.63，糖添加量15.08%，蘋果片含量198.74 g/L，對SOD活性的最佳工藝條件為：初始pH值4.64，糖添加量14.85%，蘋果片含量194.62 g/L，上述條件下，蘋果酵素感官評分和SOD活性的理論最大值分別為8.61分和41.83 U/mL。結合實際情況，將工藝調整為初始pH值4.6，糖添加量15%，蘋果片含量200 g/L，并為了確保所建回歸模型的準確性，在此條件下進行驗證，試驗重復3 次，蘋果酵素感官評分的平均值（8.45±0.24）分，SOD活性（40.26±1.03）U/mL，與預測值的相對誤差較小，說明該模型準確可靠。

2.2.4 響應曲面圖分析

初始pH值、糖添加量和蘋果片含量中任意一個變量取零水平時，其余兩個變量對蘋果酵素感官評價和SOD活性影響的響應面圖見圖4。響應曲面圖可以直觀地反映出各因素交互作用對響應值的影響，響應曲面坡度越陡峭，表明該因素對響應值的影響越敏感；反之，坡度相對平緩，表明處理條件對響應值的影響較小[26]。

如圖4所示，初始pH值和糖添加量、初始pH值和蘋果片質量濃度、糖添加量和蘋果片質量濃度之間的交互作用均較明顯，在試驗考察范圍內，各因素對蘋果酵素感官評價和SOD活性的影響由大到小依次為：初始pH值（X1）＞糖添加量（X2）＞蘋果片含量（X3），結果與方差分析一致。

圖4 各因素對蘋果酵素感官評價和超氧化物歧化酶活性影響的響應面圖Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the sensory evaluation and superoxide dismutase activity

2.3 蘋果酵素酚類物質的組成與含量研究

采用超高效液相色譜（UPLC）及液相色譜-質譜聯用技術（LC-MS）對蘋果酵素中的酚酸類化合物進行測定，結果見表6。

表6 蘋果酵素中酚類物質的組成與含量Table 6 Composition and contents of phenolics in apple enzyme

由表6可知，蘋果酵素中共檢出了15種酚類物質，其中有6種為槲皮素衍生物，這是一類在植物中廣泛分布的天然生物活性物質，具有降糖降脂功效[29]；綠原酸含量最高，為12.72 mg/L，這可能與蘋果中的綠原酸含量較高有關系[28]，原花青素B2、表兒茶素、原花青素B1含量較高，分別為4.86 mg/L、4.17 mg/L、3.34 mg/L，槲皮素-半乳糖苷、兒茶素以及根皮苷次之，分別為2.69 mg/L、1.80 mg/L、1.03 mg/L，它們共同構成蘋果酵素中主要的酚類物質。有研究表明，根皮苷是蘋果中特有的酚類物質，具有抗癌、降血糖、改善記憶力等多種生物活性[29]，而且綠原酸、根皮苷以及表兒茶素是蘋果中主要的酚類物質[30]。因此，除綠原酸外，其它酚類物質的變化與原料的關系，以及蘋果酵素自然發酵過程中酚類物質的變化規律有待于進一步研究。

3 結論

通過單因素和響應面優化試驗，得出初始pH值、糖添加量、蘋果片質量濃度等因素對蘋果酵素感官評分和SOD活性的影響顯著，優化出蘋果酵素自然發酵工藝條件為初始pH值4.6，糖添加量15%，蘋果片含量200 g/L，在此條件下蘋果酵素感官評分的平均值（8.45±0.24）分、SOD活性（40.26±1.03）U/mL，與模型預測值誤差較小。

蘋果酵素檢測出15種酚類物質，其中綠原酸含量最高，原花青素B2、表兒茶素、原花青素B1含量較高，槲皮素-半乳糖苷、兒茶素以及根皮苷次之。