一株褐藻膠降解菌的篩選與鑒定

劉文博　唐浩遠　王洪浩　唐櫻冉　劉倩文　馬榮榮　肖秀洳　張雪瑩　孫潔

【摘? 要】我國的海帶產量居全球首位，具有完整的海帶產業鏈。褐藻膠是海帶細胞的主要成分，其降解產物褐藻寡糖等具有良好的生物活性，在醫療、食品、化工等領域得到廣泛應用。較傳統的物理法和化學法進行褐藻膠的降解，采用褐藻膠裂解酶的生物法降解褐藻膠具有高效性、可控性的等優點，使得挖掘高效的褐藻膠裂解酶成為褐藻膠加工產業的重點工作。

本文從榮成海帶養殖區腐爛的海帶中篩選具有褐藻膠裂解酶活性的菌株，以海藻酸鈉為唯一碳源篩選獲得了1株具有海藻酸鈉降解活性的菌株，其最高酶活可達20.22 IU/mL。經鑒定確定其為海洋單胞菌屬（Thalassomonas sp.）的一株細菌。

【關鍵詞】海帶;褐藻膠降解菌;篩選;鑒定

1. 引言

海帶（Saccharina japonica）是褐藻綱海帶科糖藻屬的大型海藻。海帶不僅是我們補充營養的優良食品，也因具有多種醫療作用，如降低血壓^[1]、抗輻射^[2]、抗凝血^[3]、調節免疫及抗癌^[4]、促進智力發育^[5]、美膚美發^[6]等多種生理功能而成為一種經濟價值較高的褐藻。

褐藻膠是海帶細胞中的主要成分。褐藻膠由β-D-甘露糖醛酸及α-L-古洛糖醛酸兩種糖醛酸單體通過1，4-糖苷鍵隨機聚合而成的鏈狀天然高分子雜多糖^[7]。褐藻膠具有獨特的理化性質，如凝膠性及成膜性。此外其具有較好的生物活性，如免疫調節、抗腫瘤、抑菌、抗凝血、抗氧化作用，因此，褐藻膠在基礎研究、醫藥開發、食品工業等領域展現出巨大的應用價值^[8-11]。

褐藻膠可被不同方式降解后能夠得到一系列聚合度不同的低聚寡糖^[12]。目前常用的褐藻膠降解方法有：物理法、化學法、生物法。物理法降解程度不易控制，現已較少使用^[13]。化學法可分為酸降解法和氧化降解法。兩種處理方式均具有反應劇烈、易造成污染環境的缺點，同時獲得的產物的其生物活性易被破壞從而限制該方法的大規模使用^[14]。生物法又稱酶解法，主要是通過褐藻膠裂解酶對褐藻膠進行生物降解。該法克服了物理法和化學法的部分缺點，具有產率高、反應條件溫和、可控性強、無污染、產品生物活性高等特點而成為研究熱點。

褐藻膠裂解酶來源廣泛，目前主要從海洋藻類、軟體動物、棘皮動物中分離獲得。本論文從腐爛海帶中篩選了一株高活性褐藻膠降解酶菌株，可為生物法降解褐藻膠獲得褐藻寡糖提供高效的生物酶。

2.實驗材料與方法

2.1實驗材料

榮成海帶養殖區采集腐爛的海帶。

2.2 培養基

初篩培養基（g/L）：5g（NH₄）₂SO₄、2g K₂HPO₄、30g NaCl、1g MgSO4、0.01g FeSO₄、5g海藻酸鈉、2%瓊脂（固體培養基）、蒸餾水1000mL、pH7.5、121℃，滅30min。

發酵培養基（g/L）：5g蛋白胨、1g酵母膏、0.01g FeSO₄、海水1000mL、pH7.5、121℃，滅菌30min。

2.3菌株篩選

腐爛海帶2g，加入5mL無菌海水，無菌棒碾碎，漩渦震蕩1min，梯度稀釋，取合適梯度涂布到初篩培養基上，15℃培養2-3天，挑取透明圈較大的菌株接種到發酵培養基中，于15℃150 rpm條件下培養48h，利用DNS法測定酶活。

2.4酶活測定

取1 mL粗酶液和0.75%海藻酸鈉溶液于25 mL比色管中，振蕩搖勻，40℃水浴20min，加1.5mL DNS，沸水浴5 min，冷卻，定容，實驗組做每組三個平行，以0.75%海藻酸鈉和蒸餾水制成的溶液作空白對照，于520 nm下測吸光值。

酶活力單位（IU）定義：1 mL酶液在上述測定條件下，1min內水解底物產生1μg產物所需酶量定義為一個酶活力單位（IU/mL）。

酶活力公式：酶活力（IU/mL）=y×1000×n/t

式中：y為用DNS法測得OD值在葡萄糖標準曲線上對應的葡萄糖含量（mg）

n為酶液的稀釋倍數

t為酶反應時間（實驗中均為20min）

2.5菌株鑒定

測定16S rDNA保守序列，在NCBI數據庫中進行比對，獲取菌株信息，利用生物信息學軟件MEGA構建系統進化樹。

3.實驗結果與分析

3.1 菌株篩選

挑取菌落周圍有透明圈或凹陷的菌株，接種到發酵培養基上，進行復篩，DNS法計算菌株的酶活，實驗得到菌株的酶活結果如圖1所示。

從腐爛海帶中，一共篩選出21株具有褐藻膠裂解酶活性的菌株，其中篩選獲得最高酶活菌株的酶活力達到20.22 IU/mL，并將其命名為“GL1號菌”（圖1A）。

3.2GL1號菌株生物量與產酶關系

為了探究GL1號菌株最佳產酶時間，在菌株培養不同時間點進行取樣，同時測定酶活性和生物量（以OD600表示），實驗結果如圖2所示。

通過圖2可知該菌株在36h達到生長高峰，隨后細胞開始破碎死亡。在36h測得酶活力達到最大為24.10 IU/mL，隨著菌不斷的死亡，酶活力也隨之減少。

3.3GL1號菌的分子生物學鑒定

3.3.1 16S rDNA擴增及菌株鑒定

由圖3可知GL1號菌的16S rDNA片段的片段大小約為1200bp，利用NCBI中的核苷酸數據庫，對測序結果進行BLAST分析，該菌株屬于海洋單胞菌屬Thalassomonas sp.

3.3.2菌株系統發育樹分析

根據序列比對結果選取相似度較高的模式菌株，采用MEGA 7.0軟件中的NJ法，構建GL1號菌株系統發育樹，結果如圖4所示：

由圖4可知，目的菌株與海藻海洋單細胞菌Thalassomas actiniarum（NR 025717）在同一分支，親緣關系最近。

結論

本研究從腐敗海帶中成功篩選到一株高活性的褐藻膠降解酶，并對其進行鑒定為海洋單胞菌屬，為今后開發利用海帶，提高海帶的利用價值提供基礎。

致謝

本論文是在黑龍江省大學生創新創業訓練計劃項目202010214067、202010214071資助下完成的。

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本論文是在黑龍江省大學生創新創業訓練計劃項目202010214067、202010214071資助下完成的。