液氨預處理對農作物秸稈化學結構及酶解效果的影響

趙相君，李 琮，彭何歡，趙 超，馬中青

（浙江農林大學 工程學院 浙江省竹資源與高效利用協同創新中心，浙江 杭州 311300）

液氨預處理法 (liquid ammonia treatment，LAT)在氨纖維爆破預處理法 (ammonia fiber explosion,AFEX)的基礎上改進得來，通過提高反應溫度、去除爆破工藝，將氨由快速釋放轉化為慢速釋放，從而降低預處理工藝操作難度，具有非常廣闊的發展前景[1]。趙相君等[2]研究了液氨預處理法和雙氧水預處理法對稻草(水稻Oryza sativa)酶解轉化率的影響，發現雙氧水預處理后的葡聚糖和木聚糖的酶解轉化率僅為61.6%和47.8%，顯著低于液氨預處理法(88.6%和79.3%)。OLADI等[3]和ZHAO等[4]利用響應面法對液氨預處理工藝(溫度、氨添加量、反應時間等)進行了優化，當反應溫度為170 ℃、氨與原材料質量比為5∶1、載水與原材料質量比為0.8～1.6∶1.0、反應時間為10 min時，蘆竹Arundo donax葡聚糖和木聚糖的酶解轉化率最高，達到了94.2%和84.4%，總糖回收率高達530.9 g·kg?1。現有文獻主要集中于研究LAT預處理工藝對單種生物質原料酶解率的影響[5?7]，而對多種生物質經預處理后化學結構的變化規律(如微觀形貌結構、表面化學官能團、纖維素結晶度等)的研究還鮮有報道。中國是農業生產大國，農業生物質資源豐富[8]。小麥Triticum aestivum、高粱Sorghum bicolor和苜蓿Lotus corniculatus作為傳統且非常有潛力的農作物，具有栽植面積廣，產量可觀的優勢[9?11]。本研究以麥秸稈、苜蓿草、高粱秸稈及其混合物(質量比為1∶1∶1)為原料，在不同溫度條件下開展LAT預處理試驗，利用熱重分析儀(TGA)、傅里葉變化紅外光譜儀(FTIR)、X-射線衍射儀(XRD)、掃描電鏡(SEM)等對原料預處理前后的物理化學特性進行表征分析，并利用高效液相色譜(HPLC)對4類原料中葡聚糖/木聚糖的酶解轉化率進行對比，探究最理想的LAT預處理溫度及預處理前后材性的變化，為LAT預處理工藝設計提供理論依據，也為農作物轉化為生物燃料建立基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

麥秸稈取自浙江省杭州市臨安區清涼峰鎮，苜蓿草和高粱秸稈取材于甘肅省白銀市會寧縣，混合物由麥秸稈、苜蓿草、高粱秸稈按質量比1∶1∶1混合而成。先將原料烘干至含水率低于15%，再粉碎成粒徑為50～100目的粉末。用水分分析儀(MA35，賽多利斯科學儀器有限公司)測試實際含水率，測試后用密封袋密封低溫(?20 ℃)保存。纖維素酶(NS50013)和β-葡萄糖苷酶(NS50010)由諾維信公司(中國)提供。

1.2 LAT 預處理

稱取各生物質原料20 g，加去離子水，使固液質量比達到70%，攪拌均勻并平衡10 min后轉移到高壓反應釜(GCF-1 L20/350，大連自控設備廠)中，并對反應釜抽真空。將液氨注入稱量小鋼瓶，使氨與原材料的質量比為1∶1；加熱小鋼瓶至50 ℃，用以提升氨的壓力，再將氨注入反應釜。控制每組樣品的反應釜溫度在70、90、110、130、150和170 ℃下各反應5 min，反應結束后快速冷卻反應釜并釋放氨氣。取出原料，40 ℃真空烘箱中干燥24 h后測量質量和含水率，計算預處理后原料得率，再將處理后的原料放入?20 ℃的冰箱冷藏備用。

1.3 LAT預處理前后原料的物理化學特性分析

采用元素分析儀(Vario EL Ⅲ，德國 Elementary 公司) 測定預處理前后原料的元素組成；根據國家可再生能源實驗室(NREL)標準中的LAP002方法[12]測定碳水化合物相對含量，根據LAP003方法[12]測定酸不溶性木質素(Klason木質素)相對含量；采用高效液相色譜(HPLC-1200，美國安捷倫科技有限公司)測定各種單糖質量分數，并計算葡聚糖(纖維素)、木聚糖、阿拉伯聚糖等組分的相對含量；根據GB/T 2677.3?1993《造紙原料灰分的測定》標準測定原料灰分測定原料灰分。

采用熱重分析儀(TG209F1，德國耐馳儀器制造有限公司)分析預處理前后的原料的熱失重規律。稱取10 mg原料放入三氧化二鋁坩堝中，以20 ℃·min?1升溫速率升至600 ℃；載氣為高純氮氣(99.999%)，載氣流量為 40 mL·min?1，保護氣流量為 20 mL·min?1。采用傅里葉紅外光譜儀 (Nicolet 6700，美國尼高力儀器公司)分析預處理前后原料的表面官能團。稱取1 mg樣品粉末與溴化鉀(質量比1∶200)混合研磨均勻并壓片，在4 000～500 cm?1波長范圍內掃描。采用冷場發射掃描電鏡(SEM，SU8010，日本日立公司)觀察預處理前后樣品微觀結構。采用 X 射線衍射儀(XRD-6000，日本島津公司)分析預處理前后原料的結晶度進行。稱取200 mg粉末樣品，壓片處理后放入樣品室，掃描范圍為5°～40°，步長為0.05°，掃描速度為5°·min?1。根據公式計算纖維素結晶度ICr=(I002?Iam)/I002×100%。其中，I002為結晶峰的衍射強度，Iam為無定形區域衍射強度。

1.4 酶水解實驗

根據NREL標準中的LAP009[12]規程進行酶水解實驗。稱取150 mg葡聚糖當量的原料，用pH 4.8的蒸餾水-檸檬酸鈉緩沖溶液溶解得到15 mL酶解液，加入抗生素(四環素和環己酰亞胺)防止菌落滋生。預混合1 h，添加纖維素酶和β-葡萄糖苷酶，放入搖床。酶解溫度為50 ℃，搖床轉速為150 r·min?1。

酶解24和72 h時取樣，酶解液搖勻后用移液槍量取1 mL樣品注入離心管，100 ℃下放置20 min，使酶蛋白變性完全失效，?20 ℃下冷卻 5 min， 15 000 r·min?1轉速下離心5 min， 經0.22 μm聚醚砜膜過濾后注入HPLC分析瓶中，測定酶解液中的單糖相對含量。HPLC采用示差檢測器，色譜柱(HPX-87H Ion Exclusion Column，Bio-Rad 公司)條件：進樣量為 15 μL，每個樣品運行 20 min，柱溫為50 ℃，流動相為 0.005 mol·L?1稀硫酸，流速為 0.5 mL·min?1。

用實際獲得的單糖與原料中聚糖理論上可轉換的同類單糖之比表示酶解率。計算其中葡聚糖和木聚糖的酶解率d=g×15/m×c×k×1 000×100%。其中：g為HPLC測得的酶解液中葡萄糖或木糖的質量濃度(g·L?1)；m為加入原料的干基質量(g)；c為原料成分分析(酸解法)葡聚糖或木聚糖相對含量(%)；k為葡聚糖或木聚糖分別轉化為葡萄糖或木糖的系數，取0.90和0.88。總糖回收量定義為1 000 g干基材料經LAT預處理72 h后酶解所釋放的葡聚糖和木聚糖總質量之和。

2 結果與討論

2.1 LAT 預處理前后原料的物理化學特性

2.1.1 元素和化學組分分析 由表1可知：預處理前高粱秸稈中葡聚糖、木聚糖以及阿拉伯聚糖的總相對含量(58.88%)高于麥秸稈和苜蓿草，而Klason木質素和灰分的總相對含量(17.20%)低于麥秸稈和苜蓿草，表明高粱秸稈中能有效轉化為乙醇的多糖組分更多，其水解制備乙醇的潛力更大。經LAT預處理，3種原料的固體得率均出現少量下降；以高粱秸稈為例，葡聚糖、木聚糖以及阿拉伯聚糖相對含量分別從37.90%、17.63%和3.35%下降至33.72%、14.69%和3.28%，木質素從13.53%下降至10.53%；分析原因可能是液氨預處理過程中產生的誘導效應使木質素中的α-醚鍵發生斷裂，引起木質素大分子結構部分斷裂，木質素苯環上的甲基芳基醚鍵在氫氧根(OH?)作用下斷裂，發生脫甲基反應，木質素的親水性增強[13]，使得部分小分子組分從生物質中脫落，溶解于預處理反應溶液中；與此同時，多糖組分的水解轉化率得到提高[9]。如表2所示：預處理前，苜蓿草中碳和氫元素相對含量(43.79%和7.22%)及熱值(22.24 MJ·kg?1)最高，麥秸稈中氧元素相對含量(53.16%)最高；經LAT預處理，3種原料中的碳元素相對含量都有所增加，而氫和氧相對含量下降，表明LAT預處理使得生物質原料中少量含氧和氫的官能團和聯接鍵出現斷裂和脫落，如羥基(—OH)、β—O—4芳基醚鍵，造成生物質結構疏松，有利于提高酶解率[14]。此外，預處理后原料中的氮元素相對含量增加，以苜蓿草為例，氮元素相對含量增加了1.2倍，表明在LAT預處理過程中，液氨中的氮元素與生物質中的官能團發生了化學反應，形成了少量的乙酰基[15]。

2.1.2 熱重 (TGA)分析 用 20 ℃·min?1的升溫速率對原料做熱重分析，發現 LAT 預處理前后原料的熱重(TG)曲線和微分熱重(DTG)曲線不同。經LAT預處理的樣品，熱解后殘余質量百分比增加，平均增幅為2%～3%(圖1A、圖1B和圖1C)。由DTG曲線(圖1D，圖1E和圖1F)可知：原料的熱解過程可分為脫水、快速熱解和炭化3個階段[16?17]。30～200 ℃為脫水階段，此時質量損失來源于游離水和結合水的脫除，由于樣品已經經過烘干處理，因此原料失重率非常低[18?19]。當溫度升至200～400 ℃時，生物質中的纖維素和半纖維素發生快速熱解失重，預處理導致原料在此階段的最大失重峰處的失重率下降；麥秸稈從 13.02%·min?1下降至 12.16%·min?1，高粱秸稈從 13.57%·min?1下降至 12.72%·min?1，苜蓿草從14.37%·min?1下降至13.62%·min?1。結合表1可知：LAT預處理造成生物質中的葡聚糖、木聚糖和阿拉伯糖相對含量下降，使得此階段可降解物質相對含量下降，是本階段失重率下降的原因[20]。此外，由圖1E可知：高粱秸稈原料熱解時存在1個熱解失重肩峰，主要是由半纖維素熱降解產生的；但LAT預處理后的高粱秸稈此肩峰消失，表明部分半纖維素(木聚糖和阿拉伯糖)已經在LAT預處理過程中移出，半纖維素的分解使得木質素-碳水化合物復合體(LCC)被破壞，提高了樣品酶解可及度。400～800 ℃為炭化階段，此階段主要由木質素熱降解造成，木質素經過慢速熱解后逐步轉化為生物質炭[21]。

表 1 LAT 預處理前后原料的化學組分分析Table 1 Content of chemical components in biomass before and after LAT

表 2 LAT 預處理前后原料的元素分析Table 2 Ultimate analysis of biomass before and after LAT

圖 1 麥秸稈、高粱秸稈和苜蓿草在LAT預處理前后的熱重和微分熱重曲線Figure 1 TG and DTG curves of wheat straw, sorghum straw and alfalfa before and after LAT

2.1.3 傅里葉變化紅外光譜(FTIR)分析 由圖2可知：LAT預處理前后樣品的部分特征官能團的吸光度出現了輕微的變化。3 450 cm?1為羥基(—OH)的伸縮振動峰，主要來源于自由水以及纖維素、半纖維素和木質素化學結構上的羥基，經過LAT預處理后的樣品在此處的吸光度強度出現一定程度下降，表明生物質中羥基含量下降，纖維素中的氫鍵被破壞，使得生物質結構更加疏松，與ZHAO等[8]的研究結論一致。1 631 cm?1處為碳—氮(C—N)伸縮振動吸收峰，經過LAT預處理后的樣品在此處的吸光度強度出現一定程度增加，說明氨水與樣品中的3大組分(纖維素、半纖維素和木質素)發生了化學反應，氮元素以酰胺的形式存在于樣品中，與元素分析結果一致。1 595 cm?1處為苯環上碳=碳(C=C)鍵振動吸收峰，是木質素中苯丙烷基本結構單元的特征吸收峰，與原料譜圖對比，LAT預處理后峰強度減弱，且有分峰出現，說明預處理使木質素結構發生改變，部分木質素溶解于液氨并脫除出生物質，使得生物質化學結構緊密程度降低，從而降低酶解頑抗性。3種原料吸收峰從大到小依次為苜蓿草、麥秸稈、高粱秸稈，側面證明木質素相對含量大小依次為苜蓿草、麥秸稈、高粱秸稈。1 268 cm?1處吸收峰來自于纖維素和半纖維素的碳—氧(C—O )伸縮振動，對比發現，LAT預處理后該峰略微增強，歸因于木質素和半纖維素聯結生成LCC復合體，存在大量醚鍵，在堿性條件下，醚鍵斷裂，LCC復合體破壞生成苯丙烷結構單元和多糖類物質[15，22?23]。

圖 2 LAT 預處理前后樣品的紅外光譜圖Figure 2 FTIR analysis of samples before and after LAT

2.1.4 掃描電鏡(SEM)分析 由圖3可知：LAT預處理前后樣品的微觀形貌存在差異。未處理的麥秸稈纖維形狀規則，排列整齊，纖維表面存在著規則排列的硅質細胞(圖3A)，預處理后纖維排列疏松膨脹，孔隙度增加(圖3D)，有利于進一步酶解反應。經過LAT預處理的高粱秸稈纖維表面暴露程度增加(圖3B和圖3E)，苜蓿草表面結構發生扭曲和破壞，纖維暴露并出現裂紋和氣孔，表面粗糙度變大，多孔性增加(圖3C和圖3F)。由此認為：LAT預處理能有效提高樣品的比表面積，在壓力作用下，氨水滲透進細胞腔和胞間層，引起纖維素的溶脹和結晶體的相變，LCC復合體被破壞，生成大量活性基團[24]。

2.1.5 X-射線衍射(XRD)衍射分析 生物質的纖維素上存在結晶區和非結晶區，結晶度是用來表征纖維素結晶區含量的重要指標。結晶區域，纖維素鏈間以氫鍵緊密結合，纖維素大分子長鏈緊密排列，化學結構相對致密；非結晶區域，纖維素鏈隨機排列、結構疏松，較有利于纖維素酶在其表面的鍵結。因此，纖維素的結晶度能夠顯著影響木質纖維素的酶解率。由圖4可知：3種原料XRD譜圖中主要存在2個峰，分別為16°和22°處纖維素的非結晶區和結晶區衍射峰；經過LAT預處理后纖維素結晶度下降，表明LAT預處理能破壞纖維素結晶區，氫鍵發生斷裂，導致部分結晶區轉化為無定形區，使得酶在纖維素化學結構上的可及度增加，從而提升酶解轉化率[5]。

2.2 LAT 預處理對麥秸稈酶解效果的影響

如圖5所示：隨著LAT預處理溫度升高，葡聚糖的酶解轉化率呈現先增加后減小的趨勢，90 ℃時達到最大。在90 ℃下酶解24 h，葡聚糖酶解率為79.98%，是未經預處理原料的葡聚糖轉化率(30.74%)的1.60倍；酶解至72 h時，進一步增至89.98%，達到最大值。木聚糖的酶解轉化率也在90 ℃、72 h時達最高(79.03%)，是未經處理原料的木聚糖轉化率(14.87%)的4.34倍。認為90 ℃、酶解72 h為LAT預處理的最優條件。研究發現：HP預處理的最佳工藝條件下，麥秸稈總糖回收率為368.9 g；而利用優化條件下的LAT預處理，干基麥秸稈可轉化單糖569.7 g·kg?1，是未經預處理原料產糖量(195.0 g)的2.92倍，是雙氧水預處理的1.50倍，說明LAT預處理對麥秸稈酶解非常有效[11]。

圖 3 LAT 預處理前后 3 種原料的表觀形貌Figure 3 Micrograph of samples before and after LAT pretreatment

圖 4 LAT 預處理前后 3 種原料的 XRD 譜圖Figure 4 XRD analysis of samples before and after LAT

2.3 LAT 預處理對苜蓿草酶解效果的影響

如圖6所示：隨著LAT預處理溫度升高，苜蓿草葡聚糖的酶解轉化率呈現先增加后減小趨勢，110℃時達到最大值。在110 ℃下酶解24 h，葡聚糖酶解率為62.07%，比未經預處理原料的葡聚糖轉化率(45.67%)提高了36.00%。繼續酶解至72 h，葡聚糖酶解率最高可達到68.95%。木聚糖酶解轉化率與葡聚糖大致相同，110 ℃下酶解72 h時，轉化率達到最高值(68.22%)，是未經處理原料的木聚糖轉化率(11.96%)的4.70倍。110℃預處理后酶解72 h后，葡萄糖和木糖轉化的單糖得率分別為244.0和102.6 g·kg?1，單糖總產量為 316.3 g·kg?1。相比之下，低于麥秸稈的單糖產量 (569.7 g·kg?1)，推測原因是苜蓿草木質素相對含量較高，阻礙酶對纖維素和半纖維素的可及性，并與水解酶結合，導致酶水解速度降低，影響了酶解效果[8]。

2.4 LAT 預處理對高粱秸稈酶解效果的影響

如圖7所示：隨著LAT預處理溫度升高，高粱秸稈中葡聚糖酶解轉化率呈現先增加后減小的趨勢，110 ℃時轉化率達到最大值。110 ℃下酶解24 h，葡聚糖酶解率為65.26%，比未經預處理原料(51.03%)增加了14.23%。繼續酶解至72 h時，葡聚糖酶解率達到最大值(82.12%)。木聚糖酶解轉化率與葡聚糖大致相同，但相同溫度下大于葡聚糖。110 ℃酶解24 h，木聚糖轉化為率為78.58%，比未處理樣品(47.00%)提高了31.58%，酶解72 h時達到最大(91.21%)。預處理促進了原料中葡聚糖和木聚糖的酶解效果，高粱秸稈(干基)在110 ℃下酶解72 h，總糖回收量為559.5 g·kg?1，高于未處理原料(329.7 g·kg?1)，說明液氨預處理提高了高粱秸稈單糖產量，LAT預處理有效。

圖 5 LAT 預處理溫度對麥秸稈中葡聚糖/木聚糖酶解轉化率的影響Figure 5 Effect of temperatureof LAT on the glucan and xylan conversion of wheat straw

圖 6 LAT 預處理溫度對苜蓿草中葡聚糖/木聚糖酶解轉化率的影響Figure 6 Effect of temperature of LAT on the glucan and xylan conversion of alfalfa

2.5 LAT預處理對多種農作物秸稈混合物酶解效果的影響

麥秸稈、苜蓿草、高粱秸稈按質量比1∶1∶1混合，混合物葡聚糖和木聚糖的酶解轉化率隨LAT預處理溫度升高呈現先增加后減小的趨勢(圖8)，在90 ℃時達到最大值；當溫度由90℃升至170℃，混合物酶解轉化率差異不明顯。90℃下酶解24 h，混合物葡聚糖酶解率為70.19%，比未經預處理樣品的葡聚糖酶解率(50.72%)提高了19.47%；繼續酶解至72 h，葡聚糖酶解率為84.90%，比未處理樣品提高了34.18%。木聚糖酶解轉化率與葡聚糖大致相同，在90℃下酶解24 h，混合物木聚糖轉化為率70.68%，比未經預處理樣品的木聚糖轉化率(30.39%)提高了40.29%，繼續酶解至72 h，木聚糖轉化率為81.02%，比未處理樣品提高了50.63%。

圖 7 LAT 預處理溫度對高粱秸稈中葡聚糖/木聚糖酶解轉化率的影響Figure 7 Effect of temperature of LAT on the glucan and xylan conversion of sorghum straw

圖 8 LAT 預處理溫度對混合物中葡聚糖/木聚糖酶解轉化率的影響Figure 8 Effect of temperature of LAT on the glucan and xylan conversion of mixture

3 結論

采用LAT法對麥秸稈、苜蓿草、高粱秸稈以及三者混合物(質量比1∶1∶1)進行預處理，研究預處理溫度與葡聚糖和木聚糖酶解轉化率的關系，得到結論如下：①LAT預處理對生物質原料的化學結構影響顯著。LAT預處理后，原料化學組分中葡聚糖、木聚糖和阿拉伯糖的相對含量下降；元素組分中的氧和氫相對含量下降，碳和氮相對含量上升；結晶度小幅下降，生物質表面孔隙結構增強，使得酶在生物質化學結構上的可及度增加。②麥秸稈和混合物中葡聚糖和木聚糖的酶解率在LAT預處理溫度為90 ℃時達到最大值，苜蓿草和高粱秸稈在110 ℃時達到最大值。隨著酶解時間延長，4種原料葡聚糖和木聚糖的酶解率均增加；葡聚糖的最大酶解率從大到小依次為麥秸稈、混合物、高粱秸稈、苜蓿草，木聚糖的最大酶解率從大到小依次為高粱秸稈、麥秸稈、混合物、苜蓿草。