黑加侖穩定增殖體系的建立

許丁帆，劉艷軍*，范麗娜，施麗婷，楊靜慧

(1.天津農學院 園藝園林學院，天津 300384；2.浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 杭州 311300)

黑加侖(RibesnigrumL.)學名黑穗醋栗，為虎耳草科茶藨子屬小型灌木，成熟果實為黑色小漿果，既可鮮食又可以加工成果汁、果醬等食品。黑加侖含有豐富的維生素、花青素、黃酮類等物質，有著極高的保健功能和經濟價值[1-2]。目前已經知道的黑加侖的保健功效包括預防痛風、貧血、水腫、關節炎、風濕病、口腔和咽喉疾病、咳嗽等[3]。

黑加侖生產育苗主要以扦插繁殖為主[4-5]，生產效率低，長此以往會導致品種退化。對黑加侖的研究主要集中于藥用有效成分與保健功能和優質豐產栽培方面[6-8]。利用組織培養技術進行黑加侖的穩定增殖研究鮮見報道。劉文萍[9]以黑加侖新枝腋芽和頂芽為外植體，剝離莖尖進行增殖培養，產生大量芽叢而建立快繁體系。而在短時間內使用分裂素產生大量芽叢可能會引起組培苗變異，隨著組培代數的增加，組培苗變異逐漸累積，將會影響黑加侖生產質量與經濟性狀。本試驗采用黑加侖腋芽直接萌發，并配合試管扦插技術建立穩定的黑加侖組培增殖體系，對黑加侖工廠化育苗與推廣具有一定的指導意義，同時為黑加侖生理生化研究及遺傳研究等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用的兩年生黑加侖盆栽苗由天津農學院園林植物實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 組培苗的獲得

為獲得黑加侖無菌苗，試驗以黑加侖新梢為外植體，在黑加侖新梢快速生長期時，剪取新梢上部約10 cm，剪去頂芽，在超凈工作臺中剪成2～3 cm的小段，每段帶有1個腋芽，剪去葉片，保留部分葉柄。將處理好的黑加侖外植體用75%乙醇打濕后，用40%的安替福民進行表面消毒，消毒時間為5 min，無菌水沖洗外植體3次，每次10 min，并用無菌濾紙吸干后接種到1/2 MS培養基上(30 g·L-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂粉，pH 6.0)，待腋芽萌發長至3 cm左右時，將其從基部處剪下，繼續接種于1/2MS培養基上，經過20 d培養，獲得一定數量的黑加侖組培苗備用。培養條件為(25±1)℃，連續光照，光照強度為3 000 lx。

1.2.2 腋芽萌發誘導

在上一步驟獲得的黑加侖組培苗中，選取生長健壯的組培苗將其根剪去，接種到黑加侖腋芽誘導培養基上。誘導培養基采用MS培養基為基礎培養基，通過改變培養基中無機鹽含量，分別添加不同濃度的IAA和赤霉素、不同用量的蔗糖，并采用7 g·L-1瓊脂粉固化，調節pH為6.0。每個培養基中接種3個外植體，每個處理重復10次。培養條件為：連續光照，光照強度為3 000 lx，培養溫度為25±1 ℃。每天觀察記錄黑加侖腋芽誘導及生長情況，30 d后，記錄統計不同處理的萌發腋芽數及萌芽率。

1.2.3 壯苗培養

待上一步驟腋芽萌發生長至1.5 cm左右時，將其剪下，以試管扦插的方式扦插在黑加侖壯苗培養基上進行培養，壯苗培養基分別為MS、1/2 MS、MS+0.25 mg·L-1IAA、MS+0.5 mg·L-1IAA、MS+0.25 mg·L-1IAA+2.0 g·L-1活性炭、MS+0.5 mg·L-1IAA+2.0 g·L-1活性炭，并依次編號為1、2、3、4、5、6，所有培養基附加20 g·L-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂粉，調節pH值為6.0。每處理重復10瓶，每瓶接種3個小苗。培養條件與前一步驟相同。每天觀察黑加侖的生長情況，30 d后，記錄并統計試驗結果。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對黑加侖腋芽萌發的影響

本試驗通過黑加侖腋芽誘導并結合試管扦插的方式進行黑加侖的快速繁殖，對于保持增殖苗木的遺傳穩定性十分有利，為此，在試驗中盡可能采取少用激素的方式進行誘導。

由表1可知，采用MS+30 g·L-1蔗糖時，黑加侖腋芽萌發差。當MS+30 g·L-1蔗糖加入0.5 mg·L-1IAA后，有少量腋芽萌發，但萌發的腋芽生長緩慢且莖尖出現玻璃化現象。增加IAA的用量至1.0 mg·L-1后，接種的外植體生長緩慢且基部褐化，腋芽萌發數為0。在培養基配方3的基礎上加入2.0 mg·L-1赤霉素，萌發率提高，但萌發的腋芽生長緩慢。在配方4的基礎上使用半量MS無機鹽后，腋芽萌發率明顯提高，腋芽的生長速度加快。在此基礎上，又采用20 g·L-1的蔗糖降低培養基的滲透壓，結果腋芽萌發率和生長速度均明顯改善，且腋芽生長健壯。綜合以上試驗結果，黑加侖腋芽萌發誘導培養基的理想配方是：1/2 MS+0.5 mg·L-1IAA+2.0 mg·L-1GA3+20 g·L-1蔗糖。

表1 不同培養基對黑加侖腋芽萌發的影響結果

2.2 不同壯苗培養基對黑加侖生長的影響

當黑加侖小苗在側芽萌發培養基上培養一段時間后，出現生長點停止生長和植株黃化現象，繼代培養后仍不能改善。為了獲得黑加侖組培壯苗應選用新的培養基苗，才能順利移栽入土培養。為此試驗采用不同壯苗培養基，目的是獲得生長健壯的黑加侖組培苗，具體情況見表2。

表2 黑加侖在壯苗培養基上的生長結果

從表2可以看出，黑加侖壯苗培養過程中，激素和活性炭對其生長影響較大。在MS和1/2MS培養基上，外植體生長緩慢且根部均出現褐變現象，但綜合發根數和平均生長高度，MS培養基優于1/2MS。在MS培養基中加入IAA后，外植體生長速度加快，說明一定量的外源生長素能夠促進外植體生長，但在培養后期，外植體生長點出現停止生長現象，且隨著IAA用量的增加，這種現象還會加重，甚至導致生長點死亡。在培養基中添加適量活性炭之后，能有效緩解根部褐變，同時也可抑制生長點停止生長現象，說明活性炭對黑加侖組培苗生長起到促進作用。根據以上試驗結果，在MS+0.25 mg·L-1IAA+2 g·L-1活性炭+20 g·L-1蔗糖上可獲得生長健壯的黑加侖組培苗。

3 討論

3.1 組培快繁中引起遺傳變異的主要原因

在植物組培快繁研究中經常會出現組培材料遺傳變異的現象[10-11]，這對于利用組培技術進行植物營養繁殖極為不利。引起組培材料遺傳變異的因素很多，主要有以下幾個方面：第一，植物激素的使用[12]，植物激素在促進細胞分裂和分化的同時，也會造成細胞遺傳物質發生變化，從而引起變異；第二是再生方式[13]，通過愈傷組織再生途徑容易引起細胞變異，因此，在組培快繁中應避免通過愈傷組織再生或通過形成不定芽再生，本試驗選擇黑加侖腋芽萌發可以很好地避免變異的發生；第三，是采用衰老的外植體作為增殖培養材料[14]，植物細胞衰老后容易出現變異現象；此外，培養過程中不良的組培條件和微生物等都可能導致組培材料的變異，因此，應針對這些影響因素做好防范，才能建立良好穩定遺傳的組培快繁體系。

3.2 試管扦插與生長點增殖在組培快繁中各自優勢的比較

試管扦插和生長點增殖是建立植物組培快繁體系最常用的方法。如童虹宇等[15]對金佛山蘭叢芽誘導進行組培快繁、黃俊軒等[16]通過腋芽增殖獲得叢生芽建立北美海棠組培快繁體系；另一種是試管扦插，試管扦插出現較晚，本試驗采用的方法就屬于試管扦插。生長點增殖主要是利用植物組織生長點在低濃度激素作用下可以分化出大量的芽叢，然后通過分割這些芽叢來進行植株的擴繁，這種技術在組培快繁初期應用較多。采用生長點增殖的方法可以快速獲得芽叢，能在短期內得到較多的植株，在繁殖系數上占據優勢；而試管扦插的方法雖然繁殖系數較低，但可以在較短時間內獲得移栽苗，且其遺傳穩定性較高。比較以上兩種方法，從實用角度來看，試管扦插更具有優勢，這也是近年來其成為組培快繁主要方式的原因。試管扦插，省工省力，可以一次成苗，避免了多次繼代時的人工費，這對于勞動力緊張的現今社會尤為重要。同時，采用生長點增殖的方法相對試管扦插使用植物激素的種類及用量會偏多，這些激素可能會引起組培苗出現遺傳變異現象。

3.3 活性炭對組培苗生長的影響

本試驗中，在培養基中添加適量的活性炭對組培苗的生長有積極作用，有利于組培壯苗的形成。活性炭對于植物組培材料的生長影響很多，主要可以歸納為以下方面：第一，可以緩解培養基中激素、鹽分、滲透壓等不良因素對植株的影響[17]，因為活性炭可以吸附這些物質，并能緩慢釋放，從而起到了緩沖作用，減小了這些物質對植物材料的損害；第二，可以吸附植物材料釋放的有害代謝物[18-19]，從而減小這些代謝物對植物生長造成的傷害，如本試驗中采用活性炭，可以很好的吸附黑加侖組培苗代謝產物，減輕根部褐變并緩解生長點壞死現象。當前對活性炭作用的原理仍不太清楚，對于大多數植物而言在培養基中添加適量的活性炭有利于其生長，提高成苗率等。但在使用時應注意使用量，過量會造成植株材料營養不良，同時要注意使用時的顆粒大小等。

4 小結

本試驗通過對黑加侖腋芽誘導并結合試管扦插技術，篩選黑加侖壯苗培養基，建立了黑加侖穩定的組培增殖體系。其具體步驟總結如下：選取黑加侖新稍作為外植體，經外植體消毒后，獲得黑加侖無菌苗；去除無菌苗根系轉接到腋芽萌發誘導培養基1/2 MS+0.5 mg·L-1IAA+2.0 mg·L-1GA3+20 g·L-1蔗糖上，待腋芽萌發后從基部剪下接種到壯苗培養基(MS+0.25 mg·L-1IAA+2.0 g·L-1活性炭+20 g·L-1蔗糖)上進行培養，獲得黑加侖組培壯苗。本試驗結果可以直接用于黑加侖苗木的組培快繁生產和相關研究中。