河蜆抗氧化肽—鋅螯合物的制備及結構表征

劉晶晶 徐蘊桃 朱晨慧 黃倩倩 韓曜平 王雪鋒 張 然 戴陽軍

(常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500)

河蜆(Corbiculafluminea)，一種常見的軟體動物，別名黃蜆、沙蜊等，原產于亞洲，主要棲居于淡水(或咸淡水)河、湖和入海口處。河蜆營養價值高，干樣粗蛋白高達60%左右，粗脂肪約為10.91%[1]，其中糖蛋白、金屬硫蛋白等具有預防腫瘤、氧化和調節免疫等功能；含有17種氨基酸，其中必需氨基酸占總氨基酸的39%；此外，還富含EPA、DHA及大量活性多糖物質，能有效對抗心血管疾病、增強機體免疫[2]，為保健類產品的優質原材料，其藥用和食療價值引起了越來越多國內外學者的關注。

鋅作為一種人體必不可少的微量元素，與動物的感官功能和記憶有關，全球約25%的人存在缺鋅問題[3-4]。研究[5]表明，多肽—鋅螯合物可經肽消化吸收通路將鋅元素輸往血液，更利于機體利用，可彌補傳統鋅制劑利用率低和生物毒性高的不足，與氨基酸鋅相比，其吸收更快，能耗更少。

近年來，有關抗氧化肽金屬螯合物方面的研究多集中于螯合工藝條件優化及抗氧化性測定，關于螯合產物結構的研究相對較少，相關的研究[6-7]缺少對螯合原料多肽的純化，無法確保螯合原料的純度，對螯合產物的結構分析也不夠全面。試驗擬以河蜆為原料，制備抗氧化肽—鋅螯合物，采用多種光譜分析河蜆抗氧化肽螯合鋅的結構性質，為抗氧化肽金屬螯合物的構效關系及實際應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

速凍河蜆肉：江蘇省宿遷楠景水產品有限公司；

中性蛋白酶：分析純，上海藍季生物有限公司；

葡聚糖凝膠G-50：上海藍季科技發展有限公司；

雙硫腙、三氯乙酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

七水合硫酸鋅、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、水合茚三酮：分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司；

三氯化鐵、硫化鈉、鐵氰化鉀：分析純，天津致遠化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

分析天平：EL104型，梅特勒—托利多儀器制造有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH-2型，金壇市杰瑞爾電器有限公司；

高速組織搗碎機：上海市比朗儀器制造有限公司；

超低溫冰箱：BCD-216TDXZA型，青島市海爾電器股份有限公司；

臺式冷凍干燥機：Alpha 1-2 LDplus型，博勱行儀器有限公司；

高速臺式冷凍離心機：TGL-16M型，長沙市湘儀有限責任公司；

數字pH計：pHS-3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

集熱式恒溫磁力攪拌器：DF-101B型，金壇市醫療儀器廠；

自動部分收集器：BSZ-30型，上海滬西分析儀器廠；

紫外分光光度計：UV-754型，上海市精密科學儀器制造有限責任公司；

紫外—可見分光光度計：Cary300型，美國安捷倫公司；

傅立葉紅外光譜儀：Nicolet iS10型，美國賽默飛世爾科技公司；

熒光分光光度計：F-7000型，日本日立公司；

X射線衍射儀：D/max-2200/pc型，日本理學公司；

熱場發射電鏡掃描儀：ZEISS ΣIGMA型，德國卡爾蔡司。

1.2 試驗方法

1.2.1 河蜆抗氧化肽的制備

(1) 河蜆肉酶解液粉末的制備：將速凍河蜆肉解凍清洗，擠干稱重，加入2倍質量的蒸餾水，搗碎攪勻。按河蜆肉質量的3.76%添加中性蛋白酶，55.36 ℃酶解4 h[8]，100 ℃水浴滅酶20 min，冷卻后，4 000 r/min離心30 min，取上層清液，冷凍干燥，粉碎，冷藏待用。

(2) 河蜆抗氧化肽的分離純化：根據文獻[9]的方法稍作修改。取適量河蜆肉酶解液粉末，配成濃度為50 mg/mL樣液，4 000 r/min離心30 min，采用葡聚糖凝膠G-50對上清液進行分離。上樣量2 mL，蒸餾水作洗脫液，由自動收集器每5 min收集一管，樣品流速0.5 mL/min，共集400管，測定收集液的吸光度值。根據吸光度值合并相同分離峰的洗脫液，干燥成粉末，冷藏待測。

(3) 各組分總抗氧化性的測定：稱取分離后各個分離峰的酶解液粉末，分別配成50 mg/mL的溶液。量取1 mL各樣液于試管中，分別加入0.2 mol/L(pH=6.6)PBS溶液和1%的K3[Fe(CN)6]溶液各1 mL，于50 ℃水浴20 min，添加質量分數10%的三氯乙酸溶液1 mL，1 000 r/min 離心4 min。取上清液1 mL，分別加入蒸餾水1 mL和0.1%的三氯化鐵溶液0.2 mL，振動搖勻，50 ℃ 水浴10 min，溶液漸漸由黃變藍[10-11]，于700 nm處測定其吸光值。蒸餾水代替樣品作空白組。

1.2.2 河蜆抗氧化肽—鋅螯合物的制備 稱取一定量的抗氧化肽凍干粉末，配成20 mg/mL的溶液，充分攪勻，按肽鋅質量比2.18∶1加入一定量的硫酸鋅溶液，調節pH至5.07，52.65 ℃下反應46.50 min[12]，冷卻，4 000 r/min 離心20 min，取沉淀，用80%乙醇進行洗滌再離心，反復數次，上清液中分別加入雙硫腙和水合茚三酮(檢測溶液中的游離鋅離子和抗氧化肽)直至不變色。沉淀冷凍干燥備用。

1.2.3 河蜆抗氧化肽-鋅螯合物的定性檢測 根據文獻[13]略作修改。稱取少量反應產物凍干粉，蒸餾水溶解，滴入5滴茚三酮指示劑，加熱煮沸3 min，觀察是否發生顏色變化。取適量反應產物凍干粉配成溶液，添加過量的硫化鈉粉末，放置5 min，若有沉淀生成，5 000 r/min離心5 min，取上清液，滴5滴水合茚三酮指示劑，沸騰3 min，觀察是否出現顏色變化。

1.2.4 河蜆抗氧化肽—鋅螯合物的結構表征 根據文獻[6，14]的方法并稍作修改。

(1) 紫外—可見光光譜分析：將制備好的抗氧化肽—鋅螯合物配制成0.1 mg/mL溶液，8 000 r/min離心15 min，取上清液放入掃描室，設置波長190～400 nm進行掃描分析。并在相同條件下對參加反應的抗氧化肽進行處理，作為對照組。

(2) 紅外光譜分析：稱取螯合物粉末2 mg，加入適量的色譜級KBr，研磨，烘干。取少量研磨后的粉末進行壓片并置于樣品槽中，4 000～500 cm-1內掃描。并在相同條件下對參與螯合反應的抗氧化肽進行處理，作為對照組。

(3) 熒光光譜分析：分別稱取適量的抗氧化肽與抗氧化肽—鋅螯合物，配制成1 mg/mL的溶液，8 000 r/min離心20 min，取上清液用于檢測。蒸餾水作對照，設激發波長280 nm，室溫條件下測定兩種樣品在320～520 nm處的發射光譜。

(4) X射線衍射分析：取適量抗氧化肽—鋅螯合物研磨至直徑<10 μm，填入樣品槽中，鋪壓成平整試片，設置儀器參數為加速電壓40 kV，掃描范圍(2θ)5°～90°，掃描速度4°/min。并在相同條件下對參與螯合反應的抗氧化肽粉末進行預處理并掃描。

(5) 掃描電鏡分析：用牙簽挑取少量抗氧化肽和抗氧化肽—鋅螯合物粉末，均勻涂至貼有黑色雙面膠的載樣板上，再于噴金裝置內噴金。將預處理好的樣品進行掃描，掃描電鏡工作電壓5 kV，3 000×獲得圖像。

1.3 數據處理

采用Excel記錄和匯總試驗數據，采用Excel和Origin 7.0軟件進行制圖分析。

2 結果與分析

2.1 河蜆抗氧化肽的分離純化

2.1.1 葡聚糖凝膠G-50分離河蜆肉酶解液 由圖1可知，河蜆肉酶解液經分離后共得到5個清晰的洗脫峰，按洗脫液出峰的順序分別將其命名為F1、F2、F3、F4、F5。

2.1.2 河蜆肉酶解液中抗氧化肽的總抗氧化性 由圖2可知，5個組分均具有抗氧化活性，組分F2、F3的總抗氧化性能高于其他3個組分的，700 nm處的吸光值分別為2.03，1.79。鮑魚下腳料抗氧化肽最高抗氧化活性A700 nm為(0.598±0.050)[15]，蟹抗氧化肽最高抗氧化活性A700 nm為0.841[16]，說明河蜆肉酶解液抗氧化肽具有較高的研究價值。

圖1 河蜆肉酶解液的Sephadex G-50 洗脫曲線

2.2 抗氧化肽—鋅螯合物的定性分析

研究[17]表明，金屬硫化物在一般情況下的穩定常數大于抗氧化肽金屬螯合物的，當加入硫化鈉時，常溫下就可將抗氧化肽—鋅螯合物中的鋅離子置換，生成更穩定的硫化鋅沉淀，原反應物中的抗氧化肽變成游離態。通過試驗可知，抗氧化肽與鋅的反應產物經水合茚三酮指示劑在煮沸情況下檢測后未變色，無多余的游離抗氧化肽原料，說明螯合產物有一定的純度。當添加過量的硫化鈉粉末后，產生了沉淀，離心后上清液中滴加茚三酮試劑發生變色，表明上清液存在游離抗氧化肽，說明抗氧化肽與鋅發生了螯合反應。綜上，抗氧化肽與鋅發生螯合且螯合反應得到了有一定純度的螯合物粉末。

2.3 抗氧化肽—鋅螯合物的結構表征

2.3.1 紫外光譜分析 由圖3可知，抗氧化肽溶液最大吸光度對應的波長為194.02 nm，屬于抗氧化肽羰基和肽鍵的特征吸收峰。加入鋅螯合后，抗氧化肽—鋅螯合物吸收峰發生了變化，最大吸收峰接近190 nm，與螯合前的差距>4 nm，可能是鋅離子與抗氧化肽螯合后改變了原有的基團結構，基團原子的價電子發生躍遷，最大吸光度對應的波長產生移動[18]，說明抗氧化肽與鋅發生了螯合。

圖3 抗氧化肽—鋅螯合物與抗氧化肽的紫外光譜

圖4 抗氧化肽—鋅螯合物與抗氧化肽的紅外光譜

2.3.3 熒光光譜分析 由圖5可知，河蜆抗氧化肽與鋅螯合前后的熒光強度存在顯著差異(P<0.05)，螯合后的抗氧化肽分子中的熒光生色基團發生了結構上的變化，抗氧化肽中加入鋅離子后圖譜由1個強峰變為1個弱峰，說明鋅離子與抗氧化肽發生了螯合反應，改變了原有結構。

2.3.4 X射線衍射光譜分析 由圖6可知，抗氧化肽與抗氧化肽螯合鋅的衍射強度峰存在顯著差異(P<0.05)表明抗氧化肽在螯合鋅離子后，自身結構發生了一定改變。

圖5 抗氧化肽—鋅螯合物與抗氧化肽的熒光光譜

圖6 抗氧化肽—鋅螯合物與抗氧化肽的X射線衍射光譜

2.3.5 電鏡掃描結構分析 由圖7可知，抗氧化肽表面更光滑且存在空洞，可能是抗氧化肽經冷凍干燥后留下的親水區痕跡；抗氧化肽—鋅螯合物表面更粗糙，存在許多顆粒結構物質(鋅晶體)[20]，這些顆粒經電鏡掃描電擊后仍牢牢覆蓋于肽表面，使原本光滑的肽面凹凸不平，說明鋅與肽發生了相互作用且結合緊密，結構也變得更加復雜。

圖7 掃描電鏡圖

3 結論

由于制備的抗氧化肽—鋅螯合物結構較為復雜，其具體結構及一些生物活性機理有待進一步探究，鋅離子與各基團連接鍵的類型也有待進一步研究。