羊骨多肽酶法制備工藝優化及抗氧化活性研究

李曉葉張 珍王 瓊王雪琦

(1. 甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070;2. 平涼市產品質量監督檢驗中心，甘肅 平涼 744000)

羊骨中的蛋白質含量高達18.6%，其中膠原蛋白占骨蛋白的90%左右[1]。但目前羊骨主要以非深加工方式用于魚類、禽類等非反芻動物飼料的添加，利用率很低。

尋找一種天然、高效、低毒的抗氧化劑是現代科研中的一個熱門課題[2]。國內外研究[3]發現，蛋白酶可將各類動植物源蛋白序列中具有抗氧化活性的片段(即抗氧化肽)酶解分離出來。這些用天然食品制備的抗氧化肽具有分子量小、易被機體吸收、高活性的特點，可以廣泛應用于醫藥、食品、保健品等行業[4]。目前已有學者對羊骨膠原蛋白肽的酶解工藝及單酶水解羊骨粉效果比較等進行了研究，但未對其酶解液的抗氧化性進行深入研究。傅鑫森等[5]發現優化酶解工藝后得到的羊骨酶解物具有體外抗氧化活性，但未測定酶解物的還原力。

研究擬以羊骨為原料，用堿性蛋白酶對其進行酶解，優化酶解工藝，并對酶解液的抗氧化性進行測定，旨在為羊骨的深加工利用提供有效的參數支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羊骨：來源于甘肅省甘南藏族自治州瑪曲縣歐拉鄉的藏綿羊；

堿性蛋白酶：200 U/mg，上海源葉生物科技有限公司；

DPPH標準品：梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；

四硼酸鈉：分析純，天津市光復科技發展有限公司；

十二烷基硫酸鈉、焦性沒食子酸、菲洛嗪：分析純，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

pH計：PHS-3C型，上海寧隆儀器有限公司；

分析天平：FA2004B型，上海越平科學儀器有限公司；

臺式高速冷凍離心機：H-1850R型，長沙湘儀離心機儀器有限公司；

恒溫攪拌水浴鍋：HH-4A型，常州金壇精達儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羊骨多肽的制備工藝流程

羊骨→沖洗→剔除大塊肉筋→預煮(95 ℃，1 h)→高壓蒸煮(120 ℃，1 h)→烘干(60 ℃，5 h)→脫脂(無水乙醇浸泡24 h)→脫鈣(0.5 mol/L鹽酸，浸泡24 h)→蒸餾水沖洗→烘干(60 ℃，5 h)→冷卻→粉碎(過80目篩)→羊骨粉→羊骨粉加水預混合(45 ℃，10 min)→調節pH值→加入堿性蛋白酶酶解(酶解過程中每隔1 h調節一次酶解液的pH值，使其保持穩定)→滅酶(95 ℃，15 min)→離心(1 500 r/min，15 min)→上清液(酶解液)→測定水解度[6-7]

抗氧化試驗中的對照組：不添加堿性蛋白酶，其他處理同羊骨粉的酶解處理。

1.3.2 堿性蛋白酶酶解羊骨粉的工藝優化 稱取10 g羊骨粉與蒸餾水以1∶10 (g/mL)的比例在恒溫磁力攪拌器上混合均勻展開羊骨粉酶解試驗，操作如下：

(1) 酶解溫度：固定酶解pH為9.0，酶添加量為8 000 U/g 羊骨粉，分別在30，35，40，45，50 ℃下水解5 h，考察酶解溫度對羊骨粉水解度的影響。

(2) 加酶量：在確定溫度的基礎上，調節pH為9.0，加酶量分別為4 000，6 000，8 000，1 0000，12 000 U/g，水解5 h，考察加酶量對羊骨粉水解度的影響。

(3) 酶解時間：在確定酶解溫度、加酶量的基礎上，調節pH為9.0，設置酶解時間2，3，4，5，6 h，考察酶解時間對羊骨粉水解度的影響。

(4) 酶解pH：在確定酶解溫度、加酶量、水解時間的基礎上，設置pH為8.5，9.0，9.5，10.0，10.5進行酶解，考察酶解pH對羊骨粉水解度的影響。

(5) 響應面試驗：根據單因素結果，選擇酶解的時間、溫度、加酶量和pH為影響因素，以水解度(DH)為響應值，利用四因素三水平響應面優化分析法優化工藝參數。

1.3.3 水解度的測定 采用OPA法[8]。

1.3.4 抗氧化性的測定

(1) DPPH自由基清除率：參照Tai等[9]的方法，修改如下：吸取2 mL樣品與 DPPH—95%乙醇溶液相互混合，避光反應0.5 h，以3 000 r/min離心15 min，517 nm波長處測其吸光度，按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

C——DPPH自由基清除率，%；

As——2 mL樣品與DPPH溶液的吸光度；

Ac——2 mL樣品與2 mL 95%乙醇溶液的吸光度；

Ab——2 mL樣品與DPPH—95%乙醇溶液的吸光度。

(2) 羥自由基清除率：依據Zhang等[10]的方法，修改如下：取1.0 mL樣品置于試管內，先后加入鄰二氮菲—乙醇、磷酸鹽緩沖液、0.03%過氧化氫和FeSO4·7H2O，混勻，在37 ℃恒溫條件下水浴1 h，冷卻至室溫，以4 000 r/min 離心10 min，于532 nm處檢測吸光度為As，按式(2)計算羥自由基清除率。

(2)

式中：

C——羥自由基清除率，%；

As——樣品組吸光度；

Ab——空白組吸光度；

An——損傷組吸光度(去離子水代替H2O2溶液)。

(3) 超氧陰離子自由基清除能力：參照文獻[11]。

(4) 還原能力：參照文獻[12]。

1.4 統計分析

采用Design-Expert 8.0.6開展響應面試驗的設計及結果分析，利用IBM SPSS statistics 22.0軟件統計分析，借助Origin 8.5繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

如圖1所示，酶解時間選擇5 h，反應溫度選擇45 ℃，考慮經濟效益，加酶量選擇8 000 U/g，酶解pH選擇10較為適宜。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗設計及結果分析 由單因素試驗結果，選擇酶解的時間、溫度、加酶量和pH值四因素(見表1)，利用Box-Behnken中心組合原理設計四因素三水平的響應面試驗，設計及結果見表2。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對水解度與各響應變量進行回歸擬合后得各因素與響應值關系的函數：

表1 Box-Behnken試驗因素水平表

表2 響應面試驗的設計及結果

R=27.81+0.58A+1.60B+0.87C+1.20D-0.61AB+0.66AC-0.77AD-1.76BC-1.59BD-0.88CD-3.09A2-3.41B2-2.37C2-2.55D2。

(3)

對模型進行方差分析，結果見表3。

由圖2、3可知，酶解時間和酶解溫度以及酶解時間和加酶量的交互作用均對水解度影響顯著；酶解pH和酶解時間的交互作用對水解度的影響不顯著；酶解溫度和加酶量以及酶解溫度和酶解pH的交互作用均對水解度影響極顯著(P<0.01)；加酶量和酶解pH的交互作用對水解度的影響顯著。

2.2.2 模型驗證 通過響應面軟件分析得到堿性蛋白酶酶解羊骨粉的優化工藝參數為酶解時間5.09 h，酶解溫度45.80 ℃，加酶量8 213.17 U/g，酶解pH值為10.08，該條件下水解度預測值為28.11%?？紤]到試驗的可行性，調整最優工藝條件為酶解時間5 h，酶解溫度45 ℃，加酶量8 200 U/g，酶解pH 10，并進行驗證實驗(n=3)，其實測水解度為(28.36±0.02)%。說明采用響應面法優化堿性蛋白酶水解羊骨粉工藝模型可行。

2.3 羊骨酶解物的抗氧化性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由圖4可知，隨著酶解液質量濃度的增加，其DPPH自由基所具有的清除能力也逐漸提升。酶解液與對照組的IC50分別為0.90，10.75 mg/mL，說明酶解液DPPH自由基清除能力相比羊骨粉溶解液(對照組)有明顯提升(P<0.05)，可能與羊骨酶解形成的小分子多肽相關。根據相關研究[13]可知，在溶液和溶質或固相與氣相的界面，小分子多肽將會產生一種薄膜，從而對目標物加以隔離和保護。

2.3.2 羥自由基清除能力 由圖5可知，隨著酶解液質量濃度的增加，其羥自由基清除能力逐漸增強，由(61.29±0.21)%升高至(82.30±0.27)%，升高了34.28%(P<0.05)。酶解液與對照組的IC50分別為0.45，0.97 mg/mL，表明經酶解后溶液的羥自由基清除力顯著上升。試驗結果與甄潤英等[14]報道的鯰魚骨酶解物的抗氧化活性研究中羥自由基清除效果一致。

2.3.3 超氧陰離子自由基清除能力 由圖6可知，羊骨酶解液與對照組的超氧陰離子自由基清除力存在顯著差異(P<0.05)。酶解液的IC50為0.35 mg/mL，對超氧陰離子自由基的清除屬濃度依賴型。羊骨粉溶解液(對照)的IC50為0.86 mg/mL，對超氧陰離子清除率隨溶液質量濃度上升變化不明顯(P>0.05)。這是由于歧化反應和一些其他的反應可以產生過氧化氫和羥自由基[15-16]，使清除力增強，且堿性蛋白酶能夠顯著提高羊骨酶解水解度，使羊骨粉水解徹底，因而小分子量肽段產量增加，酶解液的抗氧化性增強[17]。

表3 二次回歸方程模型的方差分析?

2.3.4 還原力 由圖7可知，酶解液還原力隨著酶解液質量濃度的增加而增大。酶解組相比對照組，其還原力顯著提升，酶解液與對照組的IC50分別為2.27，1.78 mg/mL，但峰值(OD值)分別為0.689 和0.091。還原力在初始濃度下，由0.022±0.001提高至0.247±0.002(P<0.05)，在最高濃度下，由0.077±0.001提高至0.484±0.007(P<0.05)。說明酶解可以有效提升酶解液的還原力，主要與其中形成的還原性氨基酸殘基相關[13]。試驗結果與劉倩霞等[18]報道的酶解曲拉干酪素研究中還原力效果一致。

圖2 各因素的交互作用對水解度影響的響應面圖

圖3 各因素的交互作用對水解度影響的等高圖

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結論

采用響應面法對堿性蛋白酶酶解羊骨粉的工藝進行優化，并且對其酶解液的抗氧化活性進行了探究。結果表明，在酶解時間5 h，酶解溫度為45 ℃，加酶量8 200 U/g，酶解pH值10的工藝條件可以較徹底地酶解羊骨粉，提高多肽得率。經酶解后的羊骨堿性蛋白酶解液具有良好的抗氧化性，其DPPH自由基清除率、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除率以及還原力相對未被酶解的羊骨粉溶解液均顯著上升。

試驗僅研究了酶解工藝優化及酶解液的抗氧化性，后續將在此基礎上分離、純化和鑒定分子質量不相同的肽段，并探求其序列，探究肽段的結構及其內在抗氧化機制。