超聲輔助提取紫貽貝加工下腳料抗菌肽工藝優化

張 玥 楊玉霞 時光宇 趙莘芷 潘淵博 徐瓊怡

(浙江海洋大學東海科學技術學院，浙江 舟山 316000)

紫貽貝(MytilusedulisLinnaeus)俗稱“海紅”“淡菜”，廣泛分布于中國黃海、渤海、東海和南海北部，是中國主要的海洋經濟貝類。紫貽貝生產季節性強、產量大、鮮活易腐不耐貯藏，會產生大量的加工下腳料——含閉殼肌的熟貝殼、蒸煮液、受損的和小規格(<6 cm)的紫貽貝(蛋白含量為10%～23%)等[1]。目前，該下腳料的利用研究主要集中于貝殼和蒸煮液，如貝殼粉(CaCO3)/貝殼煅燒粉(CaO)作為聚丙烯塑料填充料[2]和食源性致病菌抑菌劑[3]等，蒸煮液制備海鮮調味品[4]等，而受損/小規格紫貽貝的利用研究相對較少，Beaulieu等[5]利用復合蛋白酶水解受損/小規格紫貽貝制備抗增殖活性多肽。

近年來，隨著細菌對抗生素耐藥性、抗生素殘留等問題日益嚴重，亟需尋找新型抗菌活性物質。濾食性動物貽貝長期生活在富含各種微生物水環境中(菌落總數高達6 lg CFU/mL)[6]，由于貽貝缺乏特異性的免疫系統，所以其免疫防御主要通過細胞(吞噬、包囊和呼吸爆發等)和體液(凝集素、溶酶體酶、抗菌因子等)進行免疫防御[7]。相對于其他雙殼貝類而言，抗菌肽在貽貝抵御致病菌侵襲中發揮著重要作用[8]。抗菌肽具有抑菌活性強、抑菌譜廣、不產生耐藥性以及無有害殘留等優點。目前，從貽貝的血細胞、鰓和消化腺中鑒定出多種抗菌肽，按其序列特征可分為6個家族[9]，即defensins、myticins、mytilins、mytimycins、big defensins和mytimacins。常見的貽貝抗菌肽制備方法有：① 利用甲醇[10]、乙酸溶液[11]、三氟乙酸溶液[12]、Tris-HCl/磷酸鹽緩沖液[13]等試劑浸漬提取貽貝抗菌肽，該方法可完全保持抗菌肽原有生物活性，但得率低且需大量原材料；② 采用化學合成法[14-15]，該方法存在成本高以及溶劑殘留等問題。

超聲波輔助提取法因超聲波機械效應和空化效應等特性具有得率高、提取時間短、溶劑使用量少等特點而被廣泛應用于蛋白質及酶的提取[16]。黃占旺等[17]對鯉魚魚卵中魚精蛋白的超聲波輔助硫酸提取工藝進行了優化，結果表明，超聲波輔助提取技術可使硫酸濃度和提取時間分別由7.5%、2 h減至5.0%、20 min，且獲得的魚精蛋白具有較高抑菌活性；Yuan等[18]研究解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciensstrain NJN-6)發酵液中抗真菌脂肽(iturin A和fengycin)的超聲波輔助正丁醇提取工藝，發現在超聲波功率200 W、提取時間8 min、提取次數2次、正丁醇與發酵液體積比3∶25條件下抗真菌脂肽得率最高。而有關超聲輔助提取貽貝抗菌肽的研究尚未見報道。試驗擬采用超聲輔助乙酸提取紫貽貝加工下腳料中的抗菌肽，并對其提取工藝進行優化，以期建立一種工藝操作便捷合理、得率高和抑菌活性好的提取工藝，為紫貽貝加工下腳料的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫貽貝加工下腳料：受損的和小規格的紫貽貝，收集后速凍并裝入碎冰泡沫箱，舟山市某水產公司；

金黃色葡萄球菌(GIM1.178)：廣東省微生物菌種保藏中心；

胰酪大豆胨液體培養基(Trypticase Soy Broth Medium，TSB)、胰酪大豆胨瓊脂培養基(Trypticase Soy Agar Medium，TSA)：杭州微生物試劑有限公司；

冰乙酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

組織搗碎機：Waring-8010S型，美國Waring公司；

超聲波清洗器：SK5210HP型，上海科導超聲儀器有限公司；

冷凍干燥機：LGJ-10型，北京松原華興科技發展有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：BXM-50M型，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；

生化培養箱：SPX-150B-Z型，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌肽的制備

(1) 超聲輔助乙酸法：采用先煮沸，再勻漿，然后超聲輔助提取工藝。紫貽貝加工下腳料(受損的和小規格的紫貽貝)半解凍后取肉、清洗、瀝干。準確稱取40 g紫貽貝肉加入至500 mL藍蓋螺口試劑瓶中，加入一定體積的預熱至80 ℃的一定質量分數的乙酸溶液，沸水浴30 min，冰水浴中冷卻至室溫，混合物倒入勻漿器中，18 000 r/min 勻漿20 s，倒入燒杯中，置于冷卻水循環的超聲波清洗器內，超聲提取抗菌肽，12 000 r/min離心30 min，上清液凍干后即為紫貽貝抗菌肽。

(2) 傳統乙酸法：下腳料預處理同超聲輔助乙酸法，準確稱取40 g紫貽貝肉加入至500 mL藍蓋螺口試劑瓶中，加入一定體積的預熱至80 ℃的一定質量分數的乙酸溶液，沸水浴30 min，冰水浴中冷卻至室溫，18 000 r/min勻漿20 s，倒入燒杯中，置于冷卻水循環的超聲波清洗器內，浸漬提取一定時間后，12 000 r/min離心30 min，上清液凍干后即為紫貽貝抗菌肽。其中，乙酸質量分數、液料比和提取時間均為相應超聲輔助乙酸法的優化工藝條件。

1.3.2 超聲輔助乙酸法提取工藝優化

(1) 單因素試驗：考察不同乙酸質量分數、超聲提取時間、液料比對抗菌肽得率的影響，其基本提取條件為超聲功率200 W、乙酸質量分數1.0%、超聲提取時間15 min、液料比(V乙酸∶m紫貽貝)6∶1 (mL/g)，分別考察乙酸質量分數(0.2%，0.4%，0.8%，1.6%，2.0%)、超聲提取時間(5，10，15，20，25 min)、液料比[V乙酸∶m紫貽貝分別為2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1 (mL/g)]對多肽得率和抑菌活性的影響。

(2) 響應面優化試驗：在單因素試驗基礎上，選取乙酸質量分數、超聲提取時間、液料比為自變量，抗菌肽得率為響應值，采用Box-Benhnken中心組合原理，設計三因素三水平的響應面試驗，優化超聲輔助乙酸提取紫貽貝下腳料抗菌肽工藝。

1.3.3 抗菌肽得率測定 采用Bradford等[19]的方法測定上清液中總蛋白含量，以牛血清蛋白作為標準物，繪制標準曲線(y=0.003 6x+0.286，R2=0.995 1)。按式(1)計算抗菌肽得率。

(1)

式中：

Y——抗菌肽得率，%；

c——上清液中總蛋白濃度，mg/L；

v——上清液體積，mL；

m——紫貽貝肉質量，g。

1.3.4 抑菌試驗 采用瓊脂打孔法檢測紫貽貝加工下腳料抗菌肽的抗菌活性。用0.02 mol/L pH為4.0的乙酸—乙酸鈉緩沖液將凍干抗菌肽配制成10 mg/mL多肽溶液。活化的敏感菌接種于100 mL TSB培養基中，37 ℃ 振蕩培養7～8 h(OD600 nm=0.6～0.8)，取100 μL菌液加入45 ℃已滅菌TSA培養基中，混勻，倒平板。待凝固后用滅菌打孔器(?10 mm)打孔，每孔分別加入100 μL 抗菌肽溶液，4 ℃放置60 min，37 ℃培養16～18 h后，采用十字交叉法用游標卡尺測量抑菌圈直徑。以0.02 mol/L pH為4.0的無菌乙酸—乙酸鈉緩沖液為陰性對照，用抑菌圈直徑(mm)表示抑菌活性。

1.4 數據處理

試驗結果以平均值±SD表示，利用SPSS 19.0軟件進行One-Way ANOVA分析，采用Duncan法檢驗多組數據間的差異顯著性(P<0.05)，利用OriginPro 9.1軟件進行繪圖，字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

預試驗結果顯示，紫貽貝加工下腳料抗菌肽對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑菌效果，且對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，而對枯草芽胞桿菌卻無抑菌效果(抑菌圈直徑<2 mm)。因此，后續試驗中選擇金黃色葡萄球菌為敏感菌。

2.1.1 乙酸質量分數 由圖1可知，當乙酸質量分數為0.2%～0.8%時，抗菌肽得率隨乙酸質量分數的增大顯著提高(P<0.05)，提高了61.36%；進一步增大乙酸質量分數，抗菌肽得率卻無顯著提高(P>0.05)。同時，隨著乙酸質量分數的增大，抗菌肽的抑菌活性先升高后降低，但均無顯著變化(P>0.05)，其中，乙酸質量分數為0.8%時所獲得的抗菌肽的抑菌活性最高，即抑菌圈直徑為7.54 mm。這可能是貽貝抗菌肽多為帶2～7個正電荷的堿性蛋白[20]，且酸性條件下其溶解度高[21]。由于高濃度乙酸溶液具有較高滲透壓，使細胞中非抗菌肽的蛋白等物質溶出，與抗菌肽得率的結果一致。綜合考慮，選取質量分數為0.8%左右的乙酸溶液為宜。

2.1.2 液料比 由圖2可知，當液料比(V乙酸∶m紫貽貝)為2∶1～6∶1 (mL/g) 時，抗菌肽得率隨液料比的提高顯著增加(P<0.05)，增加了83.33%；進一步提高液料比，抗菌肽得率卻無顯著變化。同時，抗菌肽的抑菌活性隨液料比的提高先升高后降低，但均無顯著變化(P>0.05)。高液料比可降低體系黏度，加快傳質過程，促進胞內抗菌肽的釋放，因而提高得率[18]。當大部分目標肽已釋放時，進一步提高液料比，得率緩慢增長。因此液料比(V乙酸∶m紫貽貝)選擇6∶1 (mL/g)左右較合理。

2.1.3 超聲提取時間 由圖3可知，當超聲提取時間為5～15 min時，抗菌肽得率隨超聲提取時間的延長顯著增加(P<0.05)，提高了70.59%，而抗菌肽的抑菌活性卻無顯著變化(P>0.05)；當超聲提取時間>15 min時，抗菌肽得率隨超聲提取時間的延長逐漸下降，但無顯著變化，而抗菌肽的抑菌活性卻顯著降低(P<0.05)。超聲波產生的空化效應破壞細胞組織，從而促使胞內抗菌肽釋放并擴散至胞外溶劑中[16]，破碎細胞內大部分抗菌肽在最初的15 min左右釋放并擴散至提取溶劑中，因此抗菌肽得率顯著增加。而超聲時間過長會引起局部過熱，導致部分蛋白結構與貽貝抗菌肽二級結構被破壞[22]，使得抗菌肽得率和抑菌活性隨之下降。因此，初步確定較適宜的超聲提取時間為15 min左右。

圖1 乙酸質量分數對抗菌肽得率與抑菌活性的影響

2.2 響應面優化

2.2.1 回歸方程的建立 利用Design-Expert 10.0.7軟件進行響應面Box-Benhnken中心組合試驗設計，試驗因素與水平見表1，試驗方案及結果見表2。通過Design-Expert軟件對試驗結果進行最小二乘法擬合回歸，得二次多元回歸方程為：

Y=1.518+0.011 25A+0.036 25B+0.112 5C+0.025AB+0.022 5AC-0.002 5BC-0.111 5A2-0.116 5B2-0.099C2。

(2)

圖2 液料比對抗菌肽得率與抑菌活性的影響

圖3 超聲提取時間對抗菌肽得率與抑菌活性的影響

表1 響應面試驗因素與水平表

表2 響應面試驗方案及結果

2.2.3 因素間交互作用 由圖4～6可知，乙酸質量分數與液料比和乙酸質量分數與超聲提取時間對抗菌肽得率的影響顯著，其響應曲面坡度陡峭，等高線寬度大；液料比與超聲提取時間的交互作用對抗菌肽得率的影響不顯著(P>0.05)，其響應曲面彎曲不明顯，等高線寬度較小[25-26]，與方差分析結果一致。

2.2.4 工藝確定及驗證實驗 由響應面法獲得抗菌肽的最佳提取工藝為乙酸質量分數0.825%、液料比(V乙酸∶m紫貽貝)6.163∶1 (mL/g)、超聲提取時間16.138 min，預測抗菌肽得率為1.553%。為便于實際操作，將抗菌肽提取工藝修正為乙酸質量分數0.8%、液料比(V乙酸∶m紫貽貝)6∶1 (mL/g)、超聲提取時間16 min，此條件下的抗菌肽得率為(1.549±0.036)%(n=3)，與預測值相對誤差<0.3%，說明利用響應面法優化獲得的抗菌肽提取工藝具有一定的可靠性。此外，傳統乙酸法提取抗菌肽得率為(0.982±0.041)%，表明超聲輔助提取可使抗菌肽得率提高57.74%(P<0.05)。

2.3 抑菌性質

由圖7可知，超聲輔助乙酸法提取的抗菌肽的抑菌圈直徑為(7.52±0.08) mm，而傳統乙酸法提取的抗菌肽的抑菌圈直徑為(6.48±0.05) mm，表明超聲輔助提取可顯著提高抗菌肽的抑菌活性(P<0.05)[27]。進一步表明超聲輔助乙酸提取紫貽貝下腳料抗菌肽的工藝是可行的。

表3 回歸模型方差分析?

圖4 乙酸質量分數與液料比的交互作用

圖5 乙酸質量分數與超聲提取時間的交互作用

圖6 液料比和超聲提取時間的交互作用

A. 超聲輔助乙酸法 B. 傳統乙酸法

3 結論

采用超聲輔助提取的方法，以乙酸溶液為提取液，通過響應面試驗優化獲得紫貽貝加工下腳料抗菌肽的最適提取工藝條件為超聲功率200 W、乙酸質量分數0.8%、液料比(V乙酸∶m紫貽貝)6∶1 (mL/g)、超聲提取時間16 min，該條件下抗菌肽得率和抑菌圈直徑分別為1.55% 和7.52 mm，均顯著高于傳統乙酸法(P<0.05)，表明該超聲輔助乙酸提取紫貽貝下腳料抗菌肽的工藝是可行的。后續將考察原料貯藏條件(溫度、時間)、提取劑類型和超聲波功率，以提高抗菌肽得率，同時對抗菌肽穩定性(熱、酸堿、凍融次數、蛋白酶)進行考察。