酶解-超聲偶聯(lián)法提取桔梗莖葉總黃酮的工藝研究

許一平 王新功 梁偉玲 李璐 宋昕(山東中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，山東 煙臺 264199)

0 引言

桔梗(Platycodon grandiflorum(Jacq.) A. DC.)為桔梗科桔梗屬多年生草本植物，是藥食同源的傳統(tǒng)中藥[1]，其根為藥用部位，主要含有三萜皂苷、黃酮類化合物等活性成分。桔梗莖葉是桔梗的地上部位，現(xiàn)代研究表明，桔梗莖葉中含有皂苷類、黃酮類等活性成分，其提取物具有明顯的抗炎、祛痰等生理活性作用[2-3]，其中的黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤及抗氧化活性等[4]。文章以總黃酮得率作為評價指標(biāo)，采用纖維素酶-超聲波偶聯(lián)提取桔梗莖葉中總黃酮，在考察單因素的基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化提取工藝條件，為進一步開發(fā)和利用桔梗非藥用部位資源桔梗莖葉提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

桔梗莖葉采摘于山東省煙臺市本校中草藥種植基地，經(jīng)山東中醫(yī)藥高等專科學(xué)校中藥鑒定教研室王蘇麗教授鑒定為桔梗科桔梗屬植物桔梗的莖葉。將采收的新鮮桔梗莖葉除去雜質(zhì)，用純水洗凈后，置干燥箱中50℃干燥，取出粉碎，過100目篩，備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品檢定研究院)；纖維素酶(3×104U/g)(安徽博美生物科技有限公司)；乙醇，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，硝酸鋁(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

KQ3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TU-1901型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；FZ102型微型植物粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；GZX-9246MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠)；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市城東新瑞儀器有限公司)；BSA224S-CW電子天平(北京賽多利斯有限公司)；Satorious PB-10酸度計(德國賽多利斯貿(mào)易有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

精密稱取115℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用60%乙醇充分溶解并定容至50mL容量瓶中，搖勻，得濃度為0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL，分別置于10mL容量瓶中，用60%乙醇補充至5mL，加5%亞硝酸鈉0.5mL，混勻靜置6min，再加10%硝酸鋁0.5mL，混勻，放置6min，加4%氫氧化鈉4.0mL，以60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min。以試劑為空白對照，在510nm波長處分別測定吸光度。以吸光度值Y為縱坐標(biāo)，以對照品溶液質(zhì)量濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=13.8436X+0.00015，r2=0.9999。

1.2.3 桔梗莖葉總黃酮的提取

(1)桔梗莖葉樣品預(yù)處理：將過篩的桔梗莖葉藥材粉末用石油醚超聲提取30 min,棄去石油醚，濾渣揮干石油醚，干燥后冷卻備用。

(2)桔梗莖葉酶解-超聲偶聯(lián)法總黃酮的提取：準(zhǔn)確稱取桔梗莖葉粉2.0g，置于125mL具塞錐形瓶中，加入一定量的纖維素酶和一定料液比及一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，用酸度計調(diào)節(jié)溶液pH值均為5.0[5-6]，在恒溫水浴鍋中以一定溫度、時間條件下酶解，15min攪拌1次。待酶解完成后設(shè)置超聲波的相關(guān)條件，在一定的溫度和時間下超聲提取，抽濾，定容100 mL，得供試品提取液。

(3)桔梗莖葉總黃酮的測定：準(zhǔn)確吸取1mL供試品提取液于10mL比色試管，按1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項下顯色方法各取3份進行平行測定，記錄吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中總黃酮的含量，并按下式計算總黃酮得率：

式中：C為總黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)；n為提取液稀釋倍數(shù)；V為提取液的體積(mL)；m為桔梗莖葉的質(zhì)量(g)。

(4)單因素試驗：分別考察纖維素酶用量：0.3%，0.6%，1.0%，2.0%，3.0%，酶解溫度：45，50，55，60，65℃；酶解時間：1h，1.5h，2h，2.5h，3h；料液比：1:10g/mL，1:15g/mL，1:20g/mL，1:25g/mL，1:30g/mL；乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)：40%，50%，60%，70%，80%；超聲溫度：40℃，50℃，60℃，70℃，80℃；提取時間：20min，30min，40min，50min，60min。按1.2.3.2下提取方法，分別進行單因素試驗。考察各因素對桔梗莖葉中總黃酮得率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 酶用量對總黃酮得率的影響

由圖1可以看出，由于纖維素酶能破壞細(xì)胞壁，有助于總黃酮的溶出，隨著纖維素酶用量的增加，總黃酮得率逐漸升高，在酶用量為0.6 %時有最大得率，但隨著酶用量的增加，過多的酶由于黏附作用，阻塞黃酮的溶出通道，使總黃酮得率呈下降趨勢。故較適宜纖維素酶用量為0.6%。

圖1 酶用量對總黃酮得率的影響

2.1.2 酶解溫度對總黃酮得率的影響

由圖2中可知，總黃酮得率隨溫度升高而增加，當(dāng)溫度55℃時，總黃酮得率達(dá)到最高值；繼續(xù)升溫，由于過高的溫度會破壞纖維素酶的活性使總黃酮的得率降低，還可能導(dǎo)致黃酮類化合物部分分解，從而降低總黃酮得率[7-8]。 因此，適宜的酶解溫度為55℃。

圖2 酶解溫度對總黃酮得率的影響

2.1.3 酶解時間對總黃酮得率的影響

由圖3中可知，隨著酶解時間的增加，總黃酮得率逐漸升高，當(dāng)酶解時間為1.5h時，總黃酮得率達(dá)到最大，隨著酶解時間的增加得率降低。因此，適宜的酶解時間為1.5h。

圖3 酶解時間對總黃酮得率的影響

2.1.4 料液比對總黃酮得率的影響

由圖4可知，隨著料液比增大桔梗莖葉總黃酮得率增高，當(dāng)料液比為1:20時總黃酮得率最大，之后料液比越大總黃酮得率呈降低的趨勢。因此，料液比1:20為佳。

圖4 料液比對總黃酮得率的影響

2.1.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率的影響

乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)不同，極性不同。由圖5可知，總黃酮得 率隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的是先增加后減少，故乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%較適宜。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率的影響

2.1.6 超聲溫度對總黃酮得率的影響

由圖6可知，隨著超聲提取溫度的升高，總黃酮的得率呈增加趨勢，溫度超過50℃以后，總黃酮得率有所下降，故取50 ℃為最佳超聲溫度。

圖6 超聲溫度對總黃酮得率的影響

2.1.7 超聲時間對總黃酮得率的影響

由圖7可知，總黃酮得率隨超聲時間延長而逐漸升高，40min后變化趨于平緩，從節(jié)能省時的角度考慮，選取超聲時間40min較適宜。

圖7 超聲時間對總黃酮得率的影響

2.2 正交試驗及結(jié)果

2.2.1 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果進行綜合分析，選取酶用量、酶解時間、酶解溫度、料液比因素，以桔梗莖葉中總黃酮得率為指標(biāo)，進行L9(34)的正交試驗。正交試驗因素水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2。

表1 L9(34)正交試驗因素水平

表2 正交試驗結(jié)果

2.2.2 正交試驗結(jié)果分析

由表2的極差分析可知，各因素對桔梗莖葉中總黃酮得率的影響主次順序為：酶用量＞酶解溫度＞料液比＞酶解時間。故酶法-超聲偶聯(lián)提取桔梗莖葉總黃酮的最佳工藝條件為A2B2C2D2，即酶用量0.6%，酶解溫度55℃，料液比1:20，酶解時間1.5h。按最佳提取工藝條件驗證試驗結(jié)果見表3。

表3 驗證試驗結(jié)果

3 結(jié)語

本研究采用纖維素酶聯(lián)合超聲提取桔梗莖葉中總黃酮，通過單因素和正交試驗分析，在超聲溫度50℃、超聲時間40min、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%的條件下，得出最佳的提取工藝為：酶用量0.6%，酶解溫度55℃，料液比l:20，酶解時間1.5h。在此提取工藝條件得到桔梗莖葉總黃酮得率為6.35 %。酶法-超聲偶聯(lián)提取桔梗莖葉總黃酮的工藝是一種新型提取方法，其操作簡單、快速、提取率高，可為桔梗莖葉中黃酮類化合物的提取研究提供技術(shù)參考，為桔梗非藥用部位資源的充分利用提供依據(jù)。