基于盆栽試驗的苯并噻唑硫酮對感染青枯病煙株根圍土壤細菌群落結構的影響

向立剛，汪漢成，郭 華，李芝義，鄭 蘋，蔡劉體，余知和

1.貴州省煙草科學研究院，貴陽市龍灘壩路29號 550081 2.長江大學生命科學學院，湖北省荊州市荊秘路88號 434025 3.貴州省疾病預防控制中心，貴陽市八鴿巖路101號 550004 4.荊州市荊州區馬山鎮農業技術服務中心，湖北省荊州市荊州區馬山鎮馬南路28號 434031

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種典型的細菌性土傳病害［1］，該病傳播速度快、分布范圍廣，在我國各煙區均有發生，是煙草生產中常見的病害之一［2］。由于煙葉生產中的連作、農藥化肥過量使用，造成土壤理化性質改變、化感自毒物質增加、病蟲害發生加劇［3-5］。研究表明，煙草連作年限越長，煙田土壤細菌多樣性與均一度越低，青枯病發生越嚴重［6-8］。而合理輪作能提高煙田土壤品質，改善土壤微生物環境［9-11］。常見輪作模式有烤煙—油菜［12］、烤煙—小麥［13］、烤煙—馬鈴薯［14］和烤煙—玉米［15］等。王欣英等［16］試驗表明，玉米根系分泌物具有抑制煙草疫霉菌孢子萌發作用，通過烤煙—玉米輪作能調節土壤理化性質、改善微生物群落結構，減少煙田土壤病害的發生率。孟玉芳等［17］研究發現，玉米根系分泌物能在短時間內殺死煙草疫霉游動孢子，并抑制其萌發，進而減輕煙草疫霉菌對煙株的侵染。玉米根系分泌物中對土壤病原菌起抑制作用的主要成分為苯并嗪類化合物丁布及其降解產物［18］。3-甲基-2（3H）苯并噻唑硫酮（簡稱苯并噻唑硫酮）作為玉米根系分泌物之一，本課題組在前期青枯病防治研究中發現，其灌根處理對煙草青枯病有較好的防治作用，而目前有關苯并噻唑硫酮防治煙草青枯病應用研究尚鮮見報道。細菌作為土壤微生物的重要組成部分，在物質循環和能量代謝方面發揮著重要作用，土壤細菌群落結構的穩定性和多樣性與植物正常生長發育及病害防治密切相關［19-20］。為此，采用Illumina MiSeq高通量測序技術對苯并噻唑硫酮灌根前后感染青枯病煙株根圍土壤細菌群落結構進行分析，旨在明確苯并噻唑硫酮對土壤細菌群落結構的影響，為有效防治煙草青枯病提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草品種為K326；青枯菌菌株由貴州省煙草科學研究院植保團隊分離獲得；盆栽土壤采自貴州省煙草科學研究院福泉基地（107°30′41″E，26°44′48″N）近3年無土傳病害發生的煙田。苯并噻唑硫酮（M30000-25G，美國SIGMA-ALDRICH公司）；DNA試劑盒為 E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（D4015-1，美國OMEGA公司）；超微量核酸定量光譜儀（NanoDrop 2000，美國 Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 盆栽試驗

將供試煙草種子播種于裝有育苗基質的專用漂浮育苗盤中，土壤風干混勻后分裝至盆缽中，每盆9.5 kg，40 d后將育苗盤中的煙苗移栽至盆缽（外徑×高=31.2 cm×19.5 cm）中。盆栽煙株置于開放的自然環境中，按常規進行栽培管理，每5 d澆水和施肥1次。

1.2.2 試驗處理與樣品采集

煙株移栽后第26天，選取20株長勢均勻的煙株，用1.0×108CFU/mL的青枯菌菌液灌根，每株的菌液用量50 mL，沿煙株莖基部灌入，并用鐵锨在根部人為制造傷口，便于病菌侵染。接菌2 d后配制苯并噻唑硫酮藥液，取0.2 g苯并噻唑硫酮原藥溶于10 mL無水乙醇中，待藥劑完全溶解后加入990 mL滅菌蒸餾水配制成1 L藥液。將20株煙隨機分為2組，處理（JY）為100 mL苯并噻唑硫酮藥液灌根，對照（CK）為100 mL滅菌蒸餾水灌根。

處理與對照各隨機選取3株煙并作標記，參照閆歡等［21］根圍土壤的采集方法，分別于灌根處理當天（0 d）、灌根后2、7、20和40 d采集煙株根圍土壤樣品，采集樣品編號見表1。采集樣品迅速裝入無菌取樣袋中，帶回試驗室置于-80℃冰箱中保存、備用。煙草青枯病等級分類參照GB/T 23222—2008［22］。

表1 采集樣品編號Tab.1 Serial numbers of collected samples

1.2.3 樣品DNA提取、擴增和測序

每個土壤樣品混合均勻后取0.5 g，采用DNA試劑盒提取樣品DNA，具體步驟按其操作說明書進行。采用超微量核酸定量光譜儀檢測提取的DNA濃度與純度，并用無菌水將樣品DNA稀釋至20 ng/μL。

以樣品DNA為模板，采用引物338F（5'-ACTC CTACGGGAGGCAGCAG-3'）和 806R（5'-GGACT ACHVGGGTWTCTAAT-3'）擴增細菌16S rRNA基因的V3～V4可變區。PCR擴增體系及反應程序參照謝紅煉等［23］的方法進行。PCR擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。純化后樣品由上海美吉生物醫藥科技有限公司利用Miseq PE300平臺（美國Illumina公司）進行高通量測序。

1.2.4 數據處理

使用Trimmomatic軟件［24］對原始序列進行過濾質控去除低質量的序列，然后使用FLASH軟件［25］進行序列拼接。使用UPARSE軟件［26］對相似度≥97%的序列進行操作分類單元（OTU）聚類，并在聚類過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier［27］將每條序列與 Silva數據庫比對進行物種分類與注釋。通過對樣品序列進行Alpha多樣性分析和物種組成分析等評估苯并噻唑硫酮對青枯病發病煙株根圍土壤細菌群落結構的影響。

2 結果與分析

2.1 苯并噻唑硫酮對青枯病的防治效果

接菌后第9天（灌根處理第7天），對照的部分煙株出現明顯青枯病癥，第30天時對照煙株發病程度十分嚴重，到第40天時煙株已全部萎蔫變黃，對照的10株煙經滅菌蒸餾水灌根后不同時期的病級和病情指數見表2。經苯并噻唑硫酮灌根處理的煙株試驗過程中未出現青枯病癥狀，且生長良好。說明苯并噻唑硫酮灌根處理對煙草青枯病有較好防治效果。

表2 對照煙株青枯病的病級調查Tab.2 Disease levels of tobacco bacterial wilt for the check tobacco plants

2.2 高通量測序深度與數據分析

由稀釋曲線（圖1）可以看出，本試驗中10組共30個樣品測序reads數均在30 000以上，樣本Sobs多樣性指數稀釋曲線在測序reads數為30 000時已趨于平緩，說明此次測序數據量合理，測序結果能夠滿足后續樣品間細菌群落結構變化的比對分析要求，更多的reads只能產生少量的新OTU。

原始數據優化處理后對照共獲得754 945條高質量序列片段，21 974 378個堿基，單一樣品序列數在44 559～61 236條之間，平均序列數為50 329條，序列平均長度為437 bp；處理共獲得868 433條高質量序列片段，25 233 613個堿基，單一樣品序列數在51 463～69 131條之間，平均序列數為57 895條，序列平均長度為436 bp。

2.3 OTU聚類分析

表3顯示，通過對不同分類水平上鑒定出的種系統計表明，對照樣品中共鑒定到細菌的37個門、99個綱、213個目、399個科、799個屬、1 686個種、4 882個OTU；處理樣品中鑒定到細菌的38個門、97個綱、213個目、402個科、814個屬、1 695個種、4 863個OTU。

圖1 稀釋曲線（OTU水平Sobs指數）Fig.1 Rarefaction curve（Sobs index at OTU level）

2.4 細菌Alpha多樣性指數分析

Alpha多樣性指數中Sobs和Chao1指數反映群落豐富度，香農指數（Shannon）和辛普森指數（Simpson）反映群落多樣性［28］。表 4顯示，對照與處理根圍土壤細菌的Sobs和Chao1指數呈現先增后減的趨勢，試驗第7天細菌豐富度達到最高，之后開始降低。苯并噻唑硫酮灌根當天處理細菌豐富度指數小于對照，試驗第40天處理豐富度指數大于對照。土壤細菌多樣性指數在處理后5個時期中除第40天外，其余4個時期的Shannon值均低于對照，處理5個時期的Simpson值均高于對照，表明前4個時期對照細菌群落多樣性高于處理，第40天時對照細菌多樣性低于處理。處理與對照5個時期的樣品覆蓋度指數（Coverage）均在97%以上，說明樣品中序列被檢測出的概率高，測序結果能夠代表樣本中細菌群落的真實情況。

表3 灌根處理后不同時期煙株根圍土壤細菌總量比較Tab.3 Comparison of total amount of bacteria in rhizospheric soil of tobacco plants at different stages after root irrigation（個）

2.5 細菌群落分析

在門水平，對照與處理樣品的細菌群落組成相似。其主要菌門包括變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、Saccharibacteria、藍細菌門（Cyanobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）和疣微菌門（Verrucomicrobia）等，但在灌根處理后不同時期與對照各菌門相對豐度存在差異，見表5。

對照煙株根圍土壤中變形菌門和擬桿菌門相對豐度顯著降低；綠彎菌門和厚壁菌門相對豐度顯著提高；放線菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門、藍細菌門和硝化螺旋菌門相對豐度略有上升，Saccharibacteria和疣微菌門相對豐度略有降低。苯并噻唑硫酮處理煙株根圍土壤中變形菌門、擬桿菌門和Saccharibacteria相對豐度顯著降低；放線菌門、綠彎菌門和厚壁菌門相對豐度顯著升高；酸桿菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門、藍細菌門、硝化螺旋菌門和疣微菌門相對豐度略微升高。表明苯并噻唑硫酮能顯著提高放線菌門相對豐度，顯著降低Saccharibacteria菌門相對豐度，而對于其他細菌門類影響較小。

表4 灌根處理后不同時期煙株根圍土壤細菌的Alpha多樣性指數比較①Tab.4 Comparison of Alpha diversity index of bacteria in rhizospheric soil of tobacco plants at different stages after root irrigation

表5 不同時期煙株根圍土壤細菌各菌門的相對豐度Tab.5 Relative abundances of bacteria phyla in rhizospheric soil of tobacco plants at different stages（%）

細菌屬水平的變化見表6。對照根圍土壤中Pseudarthrobacter、Flavisolibacter、雷 爾 氏 菌 屬（Ralstonia）、鞘脂菌屬（Sphingobium）、Massilia和Bryobacter相對豐度顯著降低；芽孢桿菌屬（Bacillus）和產黃桿菌屬（Rhodanobacter）相對豐度顯著增加；鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和Micromonospora相對豐度略有降低；芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、類 諾 卡 氏 屬（Nocardioides）、Roseiflexus和鏈霉菌屬（Streptomyces）相對豐度略微增加。處理組根圍土壤樣品中Pseudarthrobacter、鞘氨醇單胞菌屬、Flavisolibacter、鞘脂菌屬（Sphingobium）、雷爾氏菌屬和Massilia相對豐度顯著降低；芽孢桿菌屬、類諾卡氏屬和鏈霉菌屬相對豐度顯著增加；芽單胞菌屬、Roseiflexus、Bryobacter和Micromonospora相對豐度略有增加；產黃桿菌屬在5個取樣時間點均未檢出。表明苯并噻唑硫酮能顯著增加類諾卡氏屬和鏈霉菌屬的相對豐度，顯著降低鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度，而對于其他菌屬影響較小。

圖2為屬水平下對照與苯并噻唑硫酮處理后不同時期土壤樣品細菌群落熱圖，通過顏色的變化直接反映出樣品中各菌屬相對豐度的高低。顏色分布表明，除Pseudomonas、鞘脂菌屬、雷爾氏菌屬、Pseudarthrobacter和Massilia外，其余菌屬在各樣本中的相對豐度無明顯差異。熱圖上方為灌根處理后不同時期樣品的層級聚類樹。其中JY01、JY23、JY71和JY73聚為一類，JY03、JY22和JY21聚為一類，CK23、JY02、CK03、CK02和 CK01聚為一類，CK71、CK22和 CK21聚為一類，CK73、JY202、JY203、JY201和 CK72聚為一類，CK403、JY401、CK401、CK203、CK202和JY72聚為一類，CK201和JY403聚為一類，CK402和JY402與其他樣品細菌群落結構差異較大，因而各自聚為一類。處理后不同時期的樣品可聚集成為1個分支，處理相同時期3個樣品不能聚集為1個分支，說明處理相同時期的3個土壤樣品間細菌群落存在較大差異。

表6 不同時期煙株根圍土壤細菌各菌屬相對豐度Tab.6 Relative abundances of bacteria genera in rhizospheric soil of tobacco plants at different stages （%）

圖2 土壤樣品中細菌屬水平群落熱圖Fig.2 Heatmap of bacterial community in soil samples at genera level

3 討論

土壤微生物多樣性的增加在維持土壤健康和抑制植物病害方面起著十分重要的作用［29-30］。有研究表明土壤微生物多樣性的降低是導致土傳病害發生的重要原因［31］。Shiomi等［32］發現青枯雷爾氏菌很難在土壤微生物多樣性高的土壤中定殖。本研究中，苯并噻唑硫酮灌根處理后煙株根圍土壤的細菌豐富度與多樣性增加，而用滅菌蒸餾水灌根的煙株根圍土壤的豐富度與多樣性降低。因此，推測苯并噻唑硫酮灌根可能是通過增加煙株根圍土壤細菌群落多樣性，從而降低青枯雷爾氏菌在土壤中的定殖，進而達到抑制煙草青枯病的發生。

樣品細菌群落基本組成和結構分析表明，煙株根圍土壤中優勢菌門為變形菌門、放線菌門和綠彎菌門。這與施河麗等［33］試驗的青枯病發病煙株根際土壤和曹毅等［34］分析的煙草青枯病病圃土壤的研究結果基本一致。放線菌門含量通常被視為土壤健康與否的指標［35］，同時放線菌也是產生抗生素的主要菌門，經苯并噻唑硫酮灌根處理后煙株根圍土壤中放線菌門的含量顯著增加。可見苯并噻唑硫酮灌根促進煙株根圍土壤中有益微生物大量增殖，這在一定程度上可減輕煙草青枯病的危害。

為使煙株感染青枯病，試驗前期人為在土壤中加入了青枯雷爾氏菌。在苯并噻唑硫酮灌根處理后2 d，雷爾氏菌屬在苯并噻唑硫酮處理中的衰減速度高于對照；在2 d后苯并噻唑硫酮處理中雷爾氏菌屬衰減速度低于對照；20 d后苯并噻唑硫酮灌根和滅菌蒸餾水灌根煙株根圍土壤均未能檢測出雷爾氏菌屬。以此推測苯并噻唑硫酮處理的雷爾氏菌屬衰減速度先快后慢，可能與苯并噻唑硫酮的藥效有關，前期藥效高抑制雷爾氏菌屬能力強，雷爾氏菌屬衰減速度快，后期藥效減弱，抑制效果降低。但該推測有待進一步試驗驗證。煙株接種青枯菌后，滅菌蒸餾水灌根的煙株根圍土壤中雷爾氏菌屬相對豐度降低，原因目前尚不清楚，有待進一步試驗研究。

4 結論

盆栽試驗結果表明，苯并噻唑硫酮灌根能顯著抑制煙草青枯病的發生，對煙草青枯病有較好防治效果。苯并噻唑硫酮灌根增加了煙株根圍土壤細菌群落的豐富度與多樣性，并顯著提高了放線菌門、類諾卡氏屬和鏈霉菌屬等有益細菌的相對豐度，顯著降低了Saccharibacteria菌門和鞘氨醇單胞菌屬等的相對豐度。但苯并噻唑硫酮灌根并未改變煙株根圍土壤細菌的優勢菌門和菌屬，灌根后不同時期煙株根圍土壤中細菌的優勢菌門均為放線菌門、變形菌門和綠彎菌門，優勢菌屬均為Pseudarthrobacter、鞘氨醇單胞菌屬和芽單胞菌屬。