單克隆抗體下游工藝病毒清除能力的研究

文/ 王湛清

來源于細胞系的生物技術(shù)產(chǎn)品可能存在被病毒污染的風(fēng)險——其程度取決于多種因素，包括制備的來源、使用的原材料、生產(chǎn)系統(tǒng)、純化試劑和賦形劑等。研究生產(chǎn)過程對病毒的去除或滅活作用，是降低病原性病毒醫(yī)源性傳播的潛力，進而降低風(fēng)險的關(guān)鍵步驟，這對于產(chǎn)品的安全性至關(guān)重要。在生物制品進入臨床試驗和上市之前，必須證明其生產(chǎn)過程具有清除已知和假定病毒的能力。本文將從單克隆抗體（mono-clonal antibody，簡稱mAb）下游純化工藝病毒清除能力研究的方案、影響因素和創(chuàng)新及挑戰(zhàn)等方面進行論述。

1單抗產(chǎn)品病毒安全性評估

關(guān)于病毒清除能力的研究，通常是通過將已知滴度的指示病毒加入到不同生產(chǎn)工藝階段的中間品中，再測定經(jīng)特定工藝處理后的樣品中殘留病毒的滴度，最后通過計算出病毒滴度對數(shù)下降值（log reduction value，簡稱LRV）進行評價。對于LRV≥4log10的工藝步驟一般可認為是有效的病毒清除步驟。LRV＜4log10的工藝可認為有助于提高生產(chǎn)過程總病毒清除率。但是由于病毒驗證的局限性，LRV≤1log10的工藝對于病毒清除的意義不大，其LRV值不計入生產(chǎn)過程的總量中[1]。

采用模擬生產(chǎn)工藝（縮小的工藝）的方法時，應(yīng)盡量設(shè)計與實際生產(chǎn)工藝相關(guān)及合理的病毒去除/滅活研究試驗方案，尤其是有效的生產(chǎn)工藝步驟，模擬的工藝在試驗參數(shù)及控制條件方面應(yīng)與實際工藝嚴格地保持一致。

2 常用指示病毒和驗證方案

常用的指示病毒見表1。在新藥研究申請（investigational new drug，簡稱IND）階段，生物技術(shù)產(chǎn)品需要對至少2種模型病毒進行病毒清除研究，通常選擇一種逆轉(zhuǎn)錄病毒（X-MuLV）和一種細小病毒（MMV）。在生物制品許可申請（biologics license application，簡稱BLA）階段，通常使用3～5種特異性/非特異性病毒進行病毒清除研究，并評估3～5個工藝步驟，以從病毒安全性的角度證明產(chǎn)品具有足夠的安全系數(shù)。由于國內(nèi)外指導(dǎo)原則不同，用于申報的病毒清除驗證步驟存在一些差異。mAb生產(chǎn)工藝中常用的病毒清除驗證方案見表2。

表1 常用指示病毒

3 下游工藝的病毒清除能力

3.1 下游工藝對不同病毒的清除能力

截至2009年，向FDA提交的IND和BLA的單克隆抗體產(chǎn)品中[2]，Protein A親和層析、Low pH、陰離子交換層析AEX（流穿模式）、陽離子交換層析CEX（結(jié)合-洗脫模式）和除病毒過濾的病毒清除驗證最常用的指示病毒科及對其清除作用的平均值和范圍如圖1所示。

對于逆轉(zhuǎn)錄病毒，除CEX的LRV約3log10外（如圖1中a柱形圖所示），其他工藝均能夠穩(wěn)健地清除（LRV≥4log10）。皰疹病毒與逆轉(zhuǎn)錄病毒的清除效果相似且LRV＞4log10（如圖1中b柱形圖所示）。小型無包膜病毒（如細小病毒）則較難有效地清除，它們對化學(xué)處理具有耐受性，且不易被過濾器截留（如圖1中c柱形圖所示）。只有AEX和小型病毒過濾器能夠有效地清除細小病毒科（平均LRV＞4log10）。

圖 1下游工藝對逆轉(zhuǎn)錄病毒（a）、皰疹病毒（b）和細小病毒（c）清除作用的平均值

表2 mAb生產(chǎn)工藝中病毒清除驗證方案

圖1中所示工藝依次為Protein A、AEX（流穿模式）、CEX（結(jié)合-洗脫模式）、Low pH滅活（“不完全”與“完全”清除）以及大孔徑與小孔徑的除病毒過濾。

3.2 下游工藝對病毒清除能力的影響因素

各工藝的LRV值的分布情況如圖2所示。將0～2log10的研究歸為低LRV組，將大于6log10的研究歸為高LRV組進行對比分析。

圖2下游工藝在不同LRV范圍的分布情況

3.2.1 Protein A親和層析

Protein A工藝的LRV值與平衡/洗滌緩沖液、填料、洗脫液組成及洗脫pH值均無明顯相關(guān)性。低LRV組的共同點是原料相當(dāng)復(fù)雜，可能是原料與填料復(fù)雜的相互作用對層析柱去除病毒的能力產(chǎn)生了負面影響。

3.2.2 AEX（流穿模式）

Strauss等人的研究表明AEX（流穿模式）上樣的pH值和電導(dǎo)率可以影響LRV[3]。而Miesegaes等人的統(tǒng)計結(jié)果顯示，與Protein A類似，AEX（流穿模式）的LRV與不同緩沖液、填料、pH和電導(dǎo)率等變量無明顯相關(guān)性，可能原因是申報的案例工藝條件中優(yōu)化了pH和電導(dǎo)率。

3.2.3 CEX（結(jié)合-洗脫模式）

CEX工藝的病毒清除作用不夠穩(wěn)健。高LRV組的LRV與緩沖液、經(jīng)驗水平或任何層析柱性質(zhì)（如柱高和樹脂類型）無明顯相關(guān)性。然而，高LRV研究中使用的平衡/上樣及洗脫pH值均較低，為5.3±0.2；而低LRV組中pH為6.0±0.2。另一個因素是緩沖液中鹽濃度也會引起LRV值差異。低LRV研究使用的緩沖液中鹽濃度較高，上樣/平衡液中NaCl的平均濃度為290±120 mM，洗脫液中NaCl的濃度為340±70 mM，而高LRV的研究中NaCl的濃度分別為58±27 mM和183±31 mM。

3.2.4 Low pH滅活

Low pH工藝中，pH值是一個關(guān)鍵過程參數(shù)，pH為3.8時足以滅活逆轉(zhuǎn)錄病毒[4]。其中，低LRV研究組的pH值為3.9，而高LRV研究中pH值為3.4。

3.2.5 除病毒過濾

不論是小孔徑還是大孔徑的濾器，清除MuLV的LRV值均不低于2log10，只有1%的研究低于3log10（圖2中h柱形圖和i柱形圖所示）。大孔徑病毒過濾器對逆轉(zhuǎn)錄病毒的總體清除率低于小孔徑病毒過濾器（如圖1中c柱形圖所示）。影響細小病毒清除結(jié)果的主要原因是過濾器類型不同?？偟膩碚f，除病毒過過濾能夠可靠地清除病毒。

圖中工藝依次為Protein A（a）、AEX流穿模式（b）、CEX結(jié)合-洗脫模式（c）、AEX結(jié)合/洗脫模式（d）、Low pH滅活（“不完全”與“完全”清除）（e～g），以及大孔徑（h）與小孔徑（i～j）的除病毒過濾（其中，a～i：逆轉(zhuǎn)錄病毒；j：細小病毒）。

4 病毒安全性評估的創(chuàng)新與挑戰(zhàn)

生物制藥下游工藝領(lǐng)域在不斷地發(fā)展與創(chuàng)新，勢必會帶來病毒清除評估的創(chuàng)新[5]。以上游和下游工藝領(lǐng)域的進展——以連續(xù)流生物工藝為例，評估和建立有效且穩(wěn)健的病毒清除過程十分必要。在連續(xù)流過程中，諸如病毒滅活和病毒過濾等步驟預(yù)計仍將以批處理方式進行。雖然在連續(xù)流模式下，色譜過程的病毒清除能力不應(yīng)與分批處理過程有本質(zhì)區(qū)別，但必須有數(shù)據(jù)進行支持。

5 展望

從病毒學(xué)安全性的角度來看，生物制藥行業(yè)具有出色的安全性，很大程度上可以歸功于行業(yè)嚴格遵守病毒安全的3個關(guān)鍵策略：充分尋找材料和細胞庫來源并檢測，記錄病毒清除評估（病毒驗證研究）和進行過程中病毒測試。新型細胞底物生產(chǎn)的生物藥物特性可能會發(fā)生變化并伴有不同的風(fēng)險，確保生物藥物的安全性需要良好的風(fēng)險管理策略。

白帆生物擁有經(jīng)驗豐富的專業(yè)技術(shù)團隊，覆蓋從研發(fā)、小試、中試到規(guī)模化生產(chǎn)的完整產(chǎn)業(yè)鏈，建立了針對各類腫瘤和自身免疫性疾病的單克隆抗體藥物產(chǎn)業(yè)化基地，擁有獨特的NONCROS?多產(chǎn)品共線生產(chǎn)技術(shù)、智能信息化管理系統(tǒng)、高表達量的宿主細胞平臺等，可有效縮短新藥上市時間，提高有效產(chǎn)能，降低藥物成本。