冷鮮雞貨架期微生物預(yù)測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)建

瞿 洋周昌艷索玉娟張東來(lái)韓奕奕豐東升楊曉君李苗云

(1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海 201403；2. 上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，上海 201708；3. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

貨架期是指推薦條件下食品保持理想品質(zhì)的時(shí)間長(zhǎng)度[1]。微生物活動(dòng)是影響肉品貨架期的主要因素，微生物學(xué)方法是預(yù)測(cè)貨架期的常用方法[2]。利用該方法進(jìn)行貨架期預(yù)測(cè)時(shí)，使用何種微生物參數(shù)存在一定的爭(zhēng)議。研究認(rèn)為，測(cè)定某種優(yōu)勢(shì)腐敗菌是一種重要手段[3-5]，其中腸桿菌、假單胞菌和熱死環(huán)絲菌是引起雞肉腐敗變質(zhì)的常見(jiàn)微生物[6-8]。與假單胞菌相比，腸桿菌能產(chǎn)生與之相同的引起肉品風(fēng)味變化的揮發(fā)性物質(zhì)[9]，且在雞肉產(chǎn)品中含量更高[10]，所以是雞肉產(chǎn)品低溫貯藏時(shí)比假單胞菌更重要的腐敗菌。熱死環(huán)絲菌在有氧條件下產(chǎn)生丙酮、雙乙酰，無(wú)氧條件下產(chǎn)生乳酸、乙醇等揮發(fā)性化合物[11]，是無(wú)氧及微需氧環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。也有研究[12-15]認(rèn)為，不同食品中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的種類和數(shù)量存在一定差異，不同微生物間的相互作用會(huì)影響腐敗的進(jìn)程，以單一菌種作為建模對(duì)象預(yù)測(cè)貨架期不具有代表性，建議選擇菌落總數(shù)為研究對(duì)象進(jìn)行貨架期預(yù)測(cè)。

目前，貨架期預(yù)測(cè)手段主要以數(shù)學(xué)方法為主，且需通過(guò)用戶自我計(jì)算來(lái)獲得貨架期信息，缺乏直觀性。李苗云等[3]描述了假單胞菌在雞胸肉上的生長(zhǎng)，確定了生鮮雞的貨架期；董颯爽等[12]測(cè)定了菌落總數(shù)，并建立了雞胸肉產(chǎn)品的貨架期。ComBase是能在線預(yù)測(cè)微生物生長(zhǎng)的預(yù)測(cè)微生物學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(kù)，但仍需人工計(jì)算貨架期，無(wú)法直觀展示其貨架期信息。因此，研究擬選用腸桿菌、熱死環(huán)絲菌和菌落總數(shù)為微生物參數(shù)，建立冷鮮雞貨架期動(dòng)力學(xué)模型，并采用皮爾森相關(guān)分析比較上述3個(gè)微生物參數(shù)與貨架期預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度的相關(guān)性，利用Visual Basic語(yǔ)言編寫形成冷鮮雞貨架期微生物預(yù)測(cè)系統(tǒng)，并對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)際樣品驗(yàn)證，旨在實(shí)現(xiàn)計(jì)算機(jī)后臺(tái)承擔(dān)貨架期公式計(jì)算過(guò)程，使不具備微生物預(yù)測(cè)學(xué)背景的用戶僅輸入初始微生物數(shù)量和貯藏時(shí)間，即可獲得當(dāng)前冷鮮雞貨架期數(shù)值，達(dá)到簡(jiǎn)化預(yù)測(cè)模型應(yīng)用的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

冷鮮雞：構(gòu)建模型用，上海圣華食品銷售公司；

冷鮮雞：實(shí)際樣品驗(yàn)證，市售；

結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(VRBGA)、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(PCA)：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

STAA瓊脂培養(yǎng)基及添加劑：青島海博生物技術(shù)有限公司；

PBS：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高壓滅菌鍋：SX-500型，日本Tomy Digital Biology公司；

生物安全柜：1300 SERIES A2型，美國(guó)Thermo公司；

恒溫培養(yǎng)箱：Medcenter Einrichtungen GmbH型，德國(guó)Friocell公司；

恒溫振蕩培養(yǎng)箱：TQZ-312型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電子天平：AL104型，瑞士Mettler Toledo公司；

漩渦混勻儀：Vortex Genie 2型，美國(guó)Scientific Industries公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 無(wú)菌條件下分割冷鮮雞，取雞腿跟雞胸肉于無(wú)菌均質(zhì)袋中，參照文獻(xiàn)[3]，分別于5，10，15，20，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貯藏192，120，72，55，31 h，每隔一定時(shí)間取出1份樣品(1只雞腿、1份雞胸肉)。

1.2.2 感官評(píng)定 按GB 2707—2016執(zhí)行，自然光照下，對(duì)雞肉樣品的色澤、黏度、氣味和彈性等方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.2.3 微生物參數(shù)測(cè)定 無(wú)菌操作剪取雞腿肉和雞胸肉樣品，混合后取25 g加入225 mL滅菌PBS中均質(zhì)2 min，取均質(zhì)液1 mL稀釋。按GB 4789.41—2016中的腸桿菌科平板計(jì)數(shù)法測(cè)定冷鮮雞中的腸桿菌，選用平板計(jì)數(shù)法在STAA瓊脂上測(cè)定冷鮮雞中的熱死環(huán)絲菌總數(shù)，按GB 4789.2—2016測(cè)定冷鮮雞中的菌落總數(shù)。每個(gè)溫度設(shè)置3組平行，不同溫度下測(cè)定終止時(shí)間以細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)穩(wěn)定期為準(zhǔn)。

1.2.4 冷鮮雞貨架期的建立

(1) 微生物一級(jí)模型的建立：常用的一級(jí)模型有修正的Gompertz、Baranyi以及Logistic模型。修正的Gompertz模型是經(jīng)典模擬，被廣泛應(yīng)用于肉品致病菌以及腐敗菌的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)[2]。Logistic模型適合在生長(zhǎng)環(huán)境和影響因素單一時(shí)使用，另外，兩種模型適用于復(fù)雜環(huán)境。修正的Gompertz和Baranyi模型均考慮了延滯期的影響，前者適用于低溫和適溫條件下微生物的生長(zhǎng)，后者更適用于變溫環(huán)境[16-17]。試驗(yàn)采用恒溫靜態(tài)法，用修正的Gompertz方程擬合冷鮮雞肉在不同溫度貯藏時(shí)的腸桿菌數(shù)、熱死環(huán)絲菌數(shù)及菌落總數(shù)，描述不同溫度條件下上述3種目標(biāo)菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)[18]。修正的Gompertz方程如式(1) 所示。

(1)

式中：

N(t)——t時(shí)刻菌落數(shù)，CFU/g；

N0——初始菌落數(shù)，CFU/g；

Nmax——最大菌落數(shù)，CFU/g；

μmax——最大比生長(zhǎng)速率，h-1；

λ——生長(zhǎng)遲滯期，h。

(2) 微生物二級(jí)模型的建立：根據(jù)一級(jí)模型得到的冷鮮雞中腸桿菌、熱死環(huán)絲菌和細(xì)菌的最大比生長(zhǎng)速率和遲滯期，選取平方根模型擬合其與溫度之間的生長(zhǎng)關(guān)系，表達(dá)式如式(2)、(3)所示[19]。

(2)

(3)

式中：

μmax——最大比生長(zhǎng)速率，h-1；

λ——生長(zhǎng)遲滯期，h；

T——生長(zhǎng)溫度，℃；

Tmin——最低生長(zhǎng)溫度，℃；

a、b——模型參數(shù)。

(3) 冷鮮雞貨架期的建立：通過(guò)初始菌落數(shù)(N0)到最小腐敗量(Nt)所需要的增殖時(shí)間來(lái)進(jìn)行預(yù)測(cè)。按式(4)計(jì)算貨架期。

(4)

(4) 模型的驗(yàn)證：采用判定系數(shù)R2和均方根誤差(RMSE)評(píng)價(jià)一級(jí)模型，判定系數(shù)R2、偏差因子(Bf)和準(zhǔn)確因子(Af)評(píng)價(jià)二級(jí)模型，Bf和Af評(píng)價(jià)貨架期模型[20]，相對(duì)誤差評(píng)價(jià)貨架期預(yù)測(cè)系統(tǒng)。R2用來(lái)對(duì)模型方程的擬合度進(jìn)行評(píng)價(jià)，R2越接近1擬合度越高。RMSE可以用來(lái)衡量準(zhǔn)確度和離散程度。Bf顯示了預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值的偏差程度，Bf<1說(shuō)明預(yù)測(cè)值小于觀測(cè)值，表示該模型處于一個(gè)合理的范圍。Af顯示了預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值的準(zhǔn)確度，Af>1且越接近1，說(shuō)明預(yù)測(cè)值和觀測(cè)值越接近，準(zhǔn)確度較高。

(5)

(6)

(7)

式中：

μpre——預(yù)測(cè)值；

μobs——相同時(shí)間下的實(shí)測(cè)值；

n——試驗(yàn)次數(shù)。

(5) 冷鮮雞貨架期微生物預(yù)測(cè)系統(tǒng)：選用 Visual Basic(VB6 Mini)作為微生物生長(zhǎng)預(yù)測(cè)程序編寫工具。

1.3 數(shù)據(jù)處理

腐敗閾值的各指標(biāo)數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行分析，微生物預(yù)測(cè)模型數(shù)據(jù)采用Origin 8.5軟件進(jìn)行擬合，采用Excel 2007軟件繪圖，微生物參數(shù)與貨架期準(zhǔn)確度的相關(guān)性采用Matlab進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷鮮雞腐敗閾值的確定

由表1可知，當(dāng)貯藏溫度為5 ℃時(shí)，雞肉在第4天開始出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象，顏色由淡黃轉(zhuǎn)向橘黃，鮮紅轉(zhuǎn)向玫紅，且表面發(fā)黏，同時(shí)伴有異味，肉品整體呈次新鮮狀態(tài)；此時(shí)雞肉中腸桿菌、熱死環(huán)絲菌、菌落總數(shù)分別為4.433，2.735，5.141 lg(CFU/g)，將其確定為腐敗閾值。當(dāng)菌落數(shù)值達(dá)到腐敗閾值時(shí)，會(huì)促使微生物產(chǎn)生酶的信號(hào)分子，從而加速肉品品質(zhì)劣變[21]。雞肉腸桿菌的腐敗閾值與鄭夢(mèng)林等[5]的結(jié)果接近；菌落總數(shù)腐敗閾值與高燦燦等[22]的結(jié)果相吻合，與董颯爽等[12]的結(jié)果相近。

表1 5 ℃時(shí)冷鮮雞的品質(zhì)變化

2.2 冷鮮雞貨架期模型的建立

2.2.1 冷鮮雞貯藏期間一級(jí)模型的擬合 由圖1可知，雞肉腐敗過(guò)程中3種微生物參數(shù)呈不同的生長(zhǎng)狀況。由表2可知，R2>0.97，說(shuō)明修正的Gompertz方程能較好地?cái)M合試驗(yàn)中不同微生物參數(shù)的生長(zhǎng)情況。隨著貯藏溫度的升高，微生物參數(shù)最大比生長(zhǎng)速率升高，遲滯期變短。5 ℃時(shí)的最大比生長(zhǎng)速率為0.02～0.03 h-1，25 ℃時(shí)>0.3 h-1；5 ℃時(shí)遲滯期為30～42 h，25 ℃時(shí)為4～5 h，說(shuō)明貯藏溫度是影響微生物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，微生物的生長(zhǎng)隨貯藏溫度的不同而發(fā)生顯著變化，體現(xiàn)了低溫貯藏的重要性，與已有研究[23-24]相符。此外，微生物間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，在各自適宜的生長(zhǎng)溫度下，部分微生物快速生長(zhǎng)，另一部分微生物的生長(zhǎng)受到抑制。隨著貯藏溫度的升高，熱死環(huán)絲菌遲滯期的降幅顯著大于腸桿菌(P<0.05)，但其生長(zhǎng)速率的增長(zhǎng)程度小于腸桿菌。

2.2.2 冷鮮雞貯藏期間二級(jí)模型的擬合 由表3可知，貯藏溫度、生長(zhǎng)速率及遲滯期的R2>0.94，呈良好的線性關(guān)系。根據(jù)Ross對(duì)偏差因子的劃分標(biāo)準(zhǔn)，若Bf為0.90～1.05，越靠近1.00，模型越可靠；若Bf為0.70～0.90或1.05～1.15，該模型也可以被接受[25]。腸桿菌、菌落總數(shù)及熱死環(huán)絲菌μmax的Bf均為0.94～1.06，λ的Bf為1.08～1.13，模型偏差度小。Af值應(yīng)>1，越靠近1其準(zhǔn)確度越高；Braun等[26]認(rèn)為Af值為1.1～1.9時(shí)，模型均可接受。腸桿菌、熱死環(huán)絲菌及菌落總數(shù)Af為1.04～1.33，說(shuō)明模型準(zhǔn)確度高。

2.2.3 冷鮮雞貨架期模型的建立 由表4可知，腸桿菌、熱死環(huán)絲菌和菌落總數(shù)貨架期公式的Bf值為0.941 63～0.985 84，與李苗云等[3]建立的生鮮雞肉貨架期Bf值(0.999 99～1.000 52)相比，其偏差范圍較大，但屬于Ross偏差因子劃分標(biāo)準(zhǔn)的模型可靠類別；Af值為1.076 01～1.144 63，小于李苗云等[3]的結(jié)果(1.229 34～1.320 56)，說(shuō)明其準(zhǔn)確度更高，屬于Braun的可接受范圍，故試驗(yàn)冷鮮雞貨架期模型可靠。

圖1 冷鮮雞中微生物的一級(jí)模型

2.2.4 微生物參數(shù)與貨架期準(zhǔn)確度之間的相關(guān)性 由表5 可知，腸桿菌、熱死環(huán)絲菌和菌落總數(shù)的預(yù)測(cè)值與貨架期的相關(guān)系數(shù)分別為0.992 3(P<0.01)，0.992 7(P<0.01)，0.995 1(P<0.01)，即腸桿菌、熱死環(huán)絲菌和菌落總數(shù)均與冷鮮雞腐敗相關(guān)，均可用于冷鮮雞貨架期的預(yù)測(cè)。

表2 冷鮮雞中微生物一級(jí)模型生長(zhǎng)參數(shù)及模型驗(yàn)證

表3 平方根二級(jí)模型的評(píng)價(jià)

表4 冷鮮雞貨架期公式及其評(píng)價(jià)

其中，菌落總數(shù)的相關(guān)性最高，熱死環(huán)絲菌、腸桿菌的次之，說(shuō)明如果要單一地使用某種微生物參數(shù)進(jìn)行貨架期的預(yù)測(cè)，選用菌落總數(shù)會(huì)使計(jì)算結(jié)果更準(zhǔn)確。

2.3 冷鮮雞貨架期微生物預(yù)測(cè)系統(tǒng)的建立及驗(yàn)證

選用 Visual Basic 作為冷鮮雞貨架期微生物預(yù)測(cè)系統(tǒng)的編寫語(yǔ)言，設(shè)定軟件基本界面(圖2)和算法后，使用者在無(wú)需了解預(yù)測(cè)微生物模型的情況下，輸入相應(yīng)的微生物參數(shù)便可獲得冷鮮雞貨架期，該軟件程序已獲得計(jì)算機(jī)軟件著作權(quán)，登記號(hào)為2020SR0107443。

在奉賢區(qū)隨機(jī)采取8份市售冷鮮雞，2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌操作下將冷鮮雞分成兩份，一份用于初始菌落計(jì)數(shù)，另一份冷鮮雞放入4 ℃冰箱冷藏，用于感官評(píng)定，若冷鮮雞市售時(shí)未包裝，則不測(cè)定熱死環(huán)絲菌的初始菌落數(shù)(該狀態(tài)下引起冷鮮雞腐敗的主要因素為好氧腐敗菌)。由表6可知，預(yù)測(cè)系統(tǒng)的相對(duì)誤差在9%以內(nèi)，低于現(xiàn)有文獻(xiàn)[3,12]的最大相對(duì)誤差(10%～21%)，其結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。

表5 微生物參數(shù)與貨架期的皮爾森相關(guān)分析?

3 結(jié)論

試驗(yàn)測(cè)定了冷鮮雞貯藏過(guò)程中腸桿菌、熱死環(huán)絲菌和細(xì)菌總數(shù)的變化，利用修正的Gompertz模型進(jìn)行擬合獲得了冷鮮雞的貨架期計(jì)算公式，采用皮爾森相關(guān)分析比較了微生物參數(shù)與貨架期準(zhǔn)確度的關(guān)系，并通過(guò)Visual Basic編寫冷鮮雞貨架期微生物預(yù)測(cè)系統(tǒng)。結(jié)果表明，貨架期計(jì)算公式準(zhǔn)確度≥0.94；如果以某一種微生物參數(shù)進(jìn)行貨架期的預(yù)測(cè)，可選用菌落總數(shù),其計(jì)算誤差最小；使用者在輸入相應(yīng)微生物參數(shù)的初始菌落數(shù)及貯運(yùn)溫度后即可獲得冷鮮雞貨架期值，且最大相對(duì)誤差<9%。后續(xù)可開展不同貯藏溫度下冷鮮雞微生物指標(biāo)與理化指標(biāo)相關(guān)性的研究。

圖2 冷鮮雞貨架期微生物預(yù)測(cè)系統(tǒng)

表6 冷鮮雞貨架期微生物預(yù)測(cè)系統(tǒng)的驗(yàn)證