三七總皂苷對炎性內臟痛大鼠星形膠質細胞的影響及其作用機制

吳建躍 王衛民 徐海松 張眉 程軍

內臟痛（Visceral Pain，VP）是最為常見的疼痛類型之一，主要為刺激內臟器官而產生疼痛，如心、肝、脾、腎、膀胱等疼痛［1］。內臟痛患者常需要承受身體及心理上的雙重痛苦，生存質量明顯降低，如何防治內臟痛一直以來是臨床上所面臨的重要問題［2-3］。隨著研究的不斷深入，結果發現神經膠質細胞在痛覺信號的產生及傳導過程中發揮著重要的作用，星形膠質細胞（Astrocyte，AST）為機體最大的神經膠質細胞，被激活后可導致多種炎癥因子分泌增加，參與形成和維持痛覺過敏和觸誘發痛等中樞敏化過程［4］。三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）是中藥三七的主要成分，具有多種生物療效，如活血化瘀、改善微循環、降低缺血再灌注、抑制心肌細胞凋亡等［5-6］。為進一步探討AST 在內臟疼痛中的作用及其機制，本實驗擬通過對SD 大鼠腹腔注射PNS 或者NS 預處理，然后建立炎性內臟痛模型，通過注射PNS 和NS 對比，并探究不同組別GFAP 及RAS 蛋白的表達變化，進而考察三七總皂苷對炎性內臟痛大鼠星形膠質細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物：本次研究的實驗動物為健康大鼠30 只，均為雄性，體重200～300g。清潔級，由北京實驗動物中心提供，飼養于無菌、恒溫及暗明交替的清潔級環境中（明暗各12h），自由飲食飲水，適應性飼養7d，使其適應環境，避免外界刺激。（2）實驗儀器與試劑：①主要試劑：無菌生理鹽水（廠家：濰坊中匯有限公司）；冰醋酸（廠家：山西錦洋藥用輔料有限公司）；三七總皂苷（廠家：云南三七科技有限公司）。②主要儀器：高速低溫離心機（廠家：Sigma公司）；多功能酶標儀（廠家：TECAN）；蛋白電泳儀（廠家：伯樂）；熒光成像系統（廠家：Odyssey CLx）。

1.2 方法 （1）分組及給藥：大鼠隨機分為對照組（n=6）、生理鹽水組（n=12）、三七總皂苷組（n=12）。對照組的大鼠不進行處理，生理鹽水組及三七總皂苷組的大鼠預先腹腔給藥14d，每隔12h 腹腔注射，三七總皂苷預處理組每只腹腔注射7mg/ml 的三七總皂苷和生理鹽水溶液2.86ml/kg，生理鹽水預處理組每只腹腔注射2.86ml/kg。（2）炎性內臟痛模型的建立：第15 天建立大鼠疼痛模型，將小鼠放置于干凈透明的箱子中，注射1ml 1%醋酸建立急性腹膜炎模型。觀察大鼠的扭體反應，處死大鼠，觀察其相關指標。（3）RAS 檢查：采用western blot 檢測RAS 的含量，具體步驟如下。①每20～50mg 組織加入1ml 預冷的RIPA Buffer 低溫研磨（研缽提前放入液氮預冷）。使用前在每1ml 預冷的RIPA Buffer 加入10μl 磷酸酶抑制劑，10μl 蛋白酶抑制劑混勻。冰上保存數分鐘待用。②置于4℃搖床平臺上，中速（100～150rpm）振蕩1h。14000rpm（15450g），4℃離心20min，取上清液為全蛋白提取物，蛋白定量和其他蛋白質相關實驗。③聚丙烯酰胺凝膠電泳：15%丙烯酰胺膠電泳，蛋白上樣量30～50μg。④轉膜：濕轉30～100min。⑤封閉：5%脫脂奶粉室溫封閉1h。⑥孵育一抗：4℃孵育一抗過夜，抗體稀釋比例：β-actin（1 ∶10000）；RAS（1 ∶5000）。⑦孵育二抗：羊抗兔二抗（1 ∶10000），羊抗鼠二抗（1 ∶10000）。⑧Odyssey CLx 顯影。（4）GFAP 檢測：采用免疫組織化學法檢測小鼠脊髓 GFAP表達情況，具體步驟如下。①挑選脊髓切片，進行漂洗。②PBS 漂洗結束后，置脫色搖床中。③加一抗 GFAP（1 ∶1000），孵育2h 后，4℃過夜。④加羊抗鼠二抗（1 ∶200），孵育2h。⑤PBS 漂洗后，加三抗。⑥洗滌、脫水、封片。⑦觀察、計算。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗；計數資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 扭體次數 扭體反應能夠在一定程度上反應大鼠的疼痛程度，建立模型1h 后，觀察并記錄兩組大鼠的扭體次數，對照組的大鼠未出現扭體現象，生理鹽水組大鼠的扭體次數為（103.5±7.8）次，三七總皂苷組大鼠的扭轉次數為（67.6±10.6）次。與對照組比較，生理鹽水組及三七總皂苷組大鼠扭體次數明顯增加，且差異具有統計學意義（P＜0.05）；與生理鹽水組比較，三七總皂苷組大鼠的扭轉次數明顯減少，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 RAS 表達 對三組大鼠體內RAS 表達水平進行研究分析，與對照組比較，生理鹽水組（NS+HAc+NS）及三七總皂苷組（PNS+HAc+PNS）大鼠的RAS 水平明顯上升，且差異具有統計學意義（P＜0.05）；與生理鹽水組比較，三七總皂苷組大鼠RAS 含量明顯降低，且差異具有統計意義（P＜0.05），具體結果見圖1。

2.3 GFAP 表達 對三組大鼠的腰骶膨大段脊髓GFAP表達水平進行研究分析，與對照組比較，生理鹽水組及三七總皂苷組大鼠的GFAP 水平明顯升高，且差異具有統計學意義（P＜0.05）；三七總皂苷組大鼠的GFAP 水平明顯低于生理鹽水組，且差異具有統計學意義（P＜0.05），具體結果見圖2。

圖1 三組大鼠RAS表達情況

圖2 三組大鼠GFAP表達情況

3 討論

GFAP 為星形膠質細胞的標志性蛋白，具有一定的特異性，當機體受到侵損時，星形膠質細胞大量釋放，GFAP 含量明顯升高，參與神經損傷性疼痛［7］。RAS為神經遞質或神經調節因子參與脊髓痛覺的形成，為疼痛治療的新靶點。本次研究中，建立了疼痛模型的大鼠RSA、GFAP 含量明顯升高，與生理鹽水組比較，三七總皂苷組的大鼠RSA、GFAP 含量明顯降低，且差異具有統計學意義。0.6%～9%的冰醋酸可引發大鼠內臟痛而產生扭體反應，且扭體的次數與疼痛的程度關系密切，其中1%的冰醋酸所引發的大鼠扭體反應較為穩定，故通常選擇該濃度的冰醋酸建立大鼠內臟疼痛模型，在本次研究中，大鼠內臟疼痛模型建立成功。

三七總皂苷為三七的主要活性成分，具有多種藥理作用，被應用于多種疾病的治療過程中。近年來研究表明三七總皂苷具有抑制星形膠質細胞活性、促進神經原恢復的作用，表現出一定的鎮痛作用。在本資料中，對三組大鼠的扭體反應、RAS、GFAP 水平進行了考察，結果表明三七總皂苷能夠顯改善大鼠內臟疼痛，這可能與抑制星形膠質細胞的活性有關。綜上所述，三七總皂苷在內臟痛的治療過程中具有良好的效果，能夠顯著降低臨床表現，改善相關癥狀。三七總皂苷在鎮痛方面具有較大的應用價值，值得應用及推廣。