基于尿蛋白組學的CKD273在慢性腎臟病中的應用進展

徐耀　徐艷　劉昌華

【摘要】 目前，慢性腎臟病的診斷及預后缺乏準確性、敏感性，主要是受到特異性生物標志物的限制。早發現及預防并發癥的發生，以提高生存率和生活質量為目標極為關鍵。尿液是探索腎臟疾病生物標志物的寶貴資源，近年來由于組學平臺和生物信息學的迅猛發展，產生了許多關于腎纖維化的新型生物標志物的研究。基于尿蛋白質組學生物標志物的分類器CKD273與腎臟疾病和腎纖維化的嚴重程度有關，并已證明其在預測DKD及心血管事件的重大價值。CKD273具有腎臟病精準化治療的里程碑意義，基于這個成功的例子，蛋白質組學有望發展成為指導精準化干預的關鍵技術。筆者回顧了過去10年尿蛋白質組學的重大發展，重點介紹了CKD273模型在慢性腎臟病中的應用進展。

【關鍵詞】 尿蛋白組學 CKD273 慢性腎臟病 糖尿病腎病

Progress in the Application of CKD273 Based on Urine Proteomics in Chronic Kidney Disease/XU Yao， XU Yan， LIU Changhua. //Medical Innovation of China， 2020， 17（22）： -169

[Abstract] At present， the diagnosis and prognosis of chronic kidney disease lacks accuracy and sensitivity， mainly due to the limitation of specific biomarkers. Early detection and prevention of complications are critical to improving survival and quality of life. Urine is a valuable resource for exploring biomarkers of kidney disease. In recent years， due to the rapid development of omics platforms and bioinformatics， many new biomarkers of renal fibrosis have been produced. The CKD273 classifier based on urine proteome biomarkers is related to the severity of kidney disease and renal fibrosis， and has proven to be of great value in predicting DKD and cardiovascular events. CKD273 is a milestone in the precise treatment of kidney disease. Based on this successful example， proteomics is expected to develop into a key technology to guide precise intervention. We reviewed the major developments in urinary proteomics over the past 10 years， highlighting the application of CKD273 in chronic kidney disease.

[Key words] Urine proteomics CKD273 Chronic kidney disease Diabetic kidney disease

First-authors address： Jiangsu Province Subei Peoples Hospital， Clinical Medicine College， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.22.043

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是一個日益嚴重的公共衛生問題，影響全世界約17%的成年人口，65歲以上者患病率更高達20%[1]。CKD最終導致終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD），糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常見的并發癥之一，也是導致CKD的最常見原因，并且與心血管疾病的發病率和死亡率密切相關。許多大規模臨床研究表明，通過抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）系統可以保護腎功能、延緩腎臟病進展[2]，因此早期診斷CKD、延緩ESRD發生是目前研究的重點。目前，DKD早期診斷及進展評估主要基于微量白蛋白尿和腎小球濾過率估計值（estimated glomerular filtration rate，eGFR）的評估。然而，這些參數缺乏敏感性和特異性。首先，臨床上一部分糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者發生腎功能損害而沒有明顯的白蛋白尿，其次DKD患者發病初期腎臟呈高濾過狀態，當疾病進展并且50%的腎功能已經喪失時，eGFR才出現顯著降低，其是疾病進展的晚期征兆。目前，基于尿蛋白質組學的飛速發展及CKD273分類器的不斷完善為DKD的早期診斷和風險評估提供了新思路。

1 尿蛋白質組學的發展進程

蛋白質是生命機制的功能執行者，它們已被用作許多疾病的預后生物標志物，如DKD、心血管疾病和癌癥。蛋白質組是指由生物體表達的全套蛋白質，蛋白質組學是對蛋白質組的研究。蛋白質作為遺傳信息（包括環境影響）的表達結果，其水平的變化提供了有關特定疾病改變途徑的信息，因此，蛋白質組學可以用來描述生物體或器官的功能狀態，并為進一步研究疾病的分子機制提供途徑。蛋白組學可用各種不同的實驗室技術進行研究，如二維凝膠電泳，毛細管電泳耦合電噴霧電離-質譜（CE-ESI-MS），液相色譜-耦合質譜（LC-MS）和基質輔助激光解吸/電離質譜（MALDI-MS）[3]。隨著蛋白質分離技術和質譜的發展，基于CE-MS的蛋白質組學已被廣泛應用于臨床樣品的分析，可用于識別組織、細胞、體液中蛋白質的變化，其具有高敏感性、高特異性和高通量等特性，能提供一般方法無法提供的有價值的疾病信息。CE-MS已被證明是一種可運用于臨床的成熟蛋白質組學技術，其是迄今為止提供最多可比較蛋白質組學數據集的平臺，目前有超過40 000例人尿蛋白質組數據集可供使用[4]，可實現基于>10 000個受試者的蛋白質組學研究。蛋白質組學涉及生物樣品中蛋白質和多肽的大規模分離和定量，由于可同時測量多種潛在疾病的致病途徑，是早期識別DKD的有前景的技術。目前蛋白質組學研究已經確定了幾種與慢性腎衰有關的尿生物標志物，如α-1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，A1AT），細胞外谷胱甘肽過氧化物酶和載脂蛋白A-1[5]。

尿液是一種有價值的生物流體，正常生理條件下尿液應僅含有少量低/中分子量蛋白質，這些蛋白質含量在病理情況下發生變化。尿液一直是生物樣本的首選，它經過腎臟濾過、重吸收，含有穩定的肽，無須進一步處理即可進行質譜分析，因此是用于CKD的蛋白質組學研究首選的生物樣本。目前綜合運用組學檢測技術、生物信息學分析技術以及大數據信息平臺技術的CE-MS技術是用毛細管電泳（CE）分離肽，然后通過質譜（MS）鑒定，結果存儲在適當的數據庫中，隨后評估存儲在數據庫中的蛋白質組譜和臨床數據，以建立和驗證用于相關臨床目的生物標志物，而這正是目前腎臟疾病精準醫學研究的趨勢。尿蛋白質組學在尋找新的早期預測CKD及診斷的特異標志物中顯示出極大的臨床應用潛力。

2 CKD273在CKD中的應用

基于以上技術的發展，在2010年Good等[6]研究發現，與健康對照組相比，CKD組尿液中有273種肽存在差異表達，隨后其使用向量機將這273種肽組合成一種叫作CKD273的分類器，并描繪了曲線下面積（AUC）為0.96，至此，CKD273成功地將CKD患者與健康人區分開來。CKD273分類器由尿中273種差異調節尿肽組成，包括不同的膠原蛋白片段、腎特異性蛋白（鈉/鉀轉運ATP酶γ鏈，膜相關孕酮受體成分1等）、血液衍生蛋白片段（例如纖維蛋白原，載脂蛋白，血紅蛋白α鏈，纖維蛋白原α鏈等），其中主要是1型和3型膠原蛋白片段，但對應于源蛋白的肽如白蛋白，尿調節素和A1AT也在其中，因此可以同時反映多種疾病的致病途徑[6]。

此外，Genovese等[7]通過研究表明，CKD273中各種膠原蛋白片段的修飾可能表明細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的變化，這是CKD早期腎臟損害的標志，且在腎組織纖維化期間，腎間質中瘢痕組織的形成是ECM過度增生的結果。Magalh?es等[8]檢測了42個腎活檢組織的纖維化程度和對應樣本的尿蛋白質組學，發現7種纖維化相關肽與纖維化程度呈負相關，CKD273和特異性肽與腎纖維化顯著相關。

由于目前臨床上導致CKD的病因各不相同，疾病存在隱匿且發展速度不一的特點，基于eGFR或尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UAER）標準無法準確預測CKD進展，由于缺乏早期識別CKD進展的工具以及對有效的干預措施，導致CKD已成為全球增長最快的死因之一。CKD患者的尿液排泄中包含豐富的血漿蛋白片段（人血白蛋白和纖維蛋白原），這可能反映了腎小球濾過屏障的慢性損害。一項在涵蓋CKD所有階段的研究中評估了CKD273分類器的診斷和預后價值，CKD273分類器在早期腎病[eGFR大于60 mL/（min·1.73 m2]的評估中表現優于UAER和UAER/eGFR （AUCCKD273=0.93 vs AUCUAER=0.67，AUCCKD273=0.94 vs AUCUAE/eGFR=0.91）[9]。而關

于CKD273中對于疾病進展性的預測，一項納入了2 672例不同CKD分期患者的橫斷面研究顯示，在疾病早期階段，進展者eGFR下降>5 mL/（min·1.73 m2）較非進展者膠原蛋白和尿調節素片段減少;在中晚期eGFR 40～60 mL/（min·1.73 m2）進展者A1AT和人血白蛋白片段增加，而與晚期CKD eGFR<40 mL/（min·1.73m2）相關的尿肽顯示出高度可變的分布，顯示出CKD273分類器在預測CKD患者的腎功能方面表現出更高的穩定性[10]。此外，CKD273的預后準確性也超過了單個生物標志物，可能是與肽的生物學變異性有關[6]。

關于CKD273在臨床運用的證據等級，Critselis等[11]綜合分析了目前已經報道的四項前瞻性隊列研究，指出CKD273可預測微量或大量白蛋白尿的發展和eGFR的快速下降（每年下降速度>5%），根據牛津循證醫學（Oxford Evidence-Based Medicine，EBM）和推薦分類法（Strength of Recommendation Taxonomy，SORT）指南證據等級分別被歸為1b級和1～4分，且分類器的效能與年齡、性別和所用尿液儲存容器的類型無關。

Argilés等[12]對76例不同程度的CKD患者進行了尿蛋白質組的檢測并進行了長達6年的隨訪發現，CKD273是第一個在獨立隊列研究中成功預測CKD進展預后的蛋白質組學分類器。隨后，文獻[13]將研究對象擴大到一般人群，評估了CKD273與腎功能相關的橫斷面和縱向關聯，并且前瞻性地研究與心血管并發癥的關聯，認為CKD273在預測早期CKDeGFR>70 mL/（min·1.73 m2）進展的價值較高，在疾病晚期中效能降低。

鑒于膠原片段的改變是腎臟和心血管疾病進展的關鍵，1型和3型膠原在血管中比腎小球基底膜改變更加明顯，CKD273可能不僅僅是CKD的標志物，也是心血管疾病的非特異性標志物。有報道稱，尿蛋白質組學標記物可在傳統危險因素不明顯的人群中識別出發生CVD或死亡的高風險患者，并且為平均風險較低的人群提供更準確的風險預測，從而可以為臨床決策提供依據[14]。

3 CKD273在DKD中的應用

DKD是慢性腎臟病的主要病因之一，其發展特征是尿白蛋白排泄率從無蛋白尿到微量蛋白尿再到大量蛋白尿。微量白蛋白尿（30～300 mg/24 h）被認為是目前預測DKD發展的最佳指標，然而由于個體的差異性，其在臨床上的準確性受到很大影響。有報道稱，近半數的Ⅰ型糖尿病患者并未檢測出明顯的白蛋白尿，然而腎功能已受到嚴重損害，這表明白蛋白尿缺乏敏感性[15]。目前，CKD273分類器已被證實與正常白蛋白尿患者進展為微量白蛋白尿（microalbuminuria，MA）有關[16]，早期識別可能進展為微量白蛋白尿的個體對DKD的早期治療有重要意義。已有研究表明，包括膠原蛋白片段、α-微球蛋白、β2-微球蛋白、A1AT、尿調節素等尿肽是一種有前途的生物標志物組，可用于早期檢測T2DM患者發展至DKD階段[16]。基于尿膠原片段與腎功能相關的多個觀察結果，有學者認為在CKD尤其是在DKD中，生理性膠原蛋白降解減弱，這導致ECM中的膠原蛋白增加和纖維化，使得CKD273能夠檢測具有進展至DKD的風險的糖尿病患者，而與尿白蛋白濃度無關[17]，其為早期診斷非蛋白尿糖尿病腎病（normoalbuminuric diabetic kidney disease，NADKD）帶來了新希望[18]。

最近的橫斷面研究檢測了155例2型糖尿病患者的MA并用CE-MS進行蛋白質組學分析以測定CKD273分類器評分，并以全因死亡率作為終點進行6年的隨訪，結果顯示在Cox回歸模型中UAER（β=0.402，P<0.001）和eGFR（β=-0.184，P=0.039）是CKD273的決定因素[19]，而UAER和eGFR已被證實是DKD和一般人群心血管事件和死亡率的獨立預測因子[20]。除了預后價值外，有研究發現厄貝沙坦在DKD中治療兩年后CKD273評分發生顯著改變且與健康人相近[21]。此外，在一項名為PRIORITY的國際多中心臨床試驗和觀察性研究中，該分類器被證明可用于監測DKD患者管理并進行危險程度分層，此外，該實驗還闡明了早期檢測糖尿病腎病與螺內酯治療相結合的潛在益處[22]。另外，在早期檢測DKD進行特異性治療的效用目前正在進行多中心的前瞻性試驗[23]。

4 其他腎臟病中的應用

尿蛋白質組學同樣也應用于其他腎臟病領域，例如狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）或常染色體顯性多囊腎病（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）。血管緊張素Ⅱ-調節蛋白在離體腎組織被發現，并且在體內的動物腎臟模型中得到驗證。有學者發現，相比于與非ADPKD腎臟病，其在ADPKD患者中的尿排泄率較低，考慮可能與囊腫導致的腎小管損傷有關[24]。在一項包含88例系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者的病例對照研究中，尿α-1抗胰凝乳蛋白酶，視黃醇結合蛋白和觸珠蛋白被鑒定為LN活動的潛在生物標志物[25]。

5 展望

綜上所述，目前初步研究已證實了尿蛋白質組學以及CKD273分類器在CKD早期診斷及預后方面的巨大潛力，考慮到尿液標本收集的非侵入性和尿蛋白質組的相對穩定性，CKD273目前正在進行大規模的臨床試驗以評估其診斷效能，并通過了美國食品和藥物管理局（FDA）的認可[26]，但需要更多大樣本多中心臨床試驗來證明其臨床效能。我們下一步努力的方向是在生物標志物組中單獨或組合地研究所提出的肽，并且可能添加目前未發現的新肽，以找到標記CKD診斷、預后潛力最大價值的組合。另外，想要尿蛋白組學進一步運用于臨床，將精準的科研，實驗室和軟件開發實踐于CKD273的質量控制和驗證是必不可少的。

參考文獻

[1] Bruck K，Stel V S，Gambaro G，et al.CKD Prevalence Varies across the European General Population[J].J Am Soc Nephrol，2016，27（7）：2135-2147.

[2] Brenner B M，Cooper M E，de Zeeuw D，et al.Effects of losartan on renal and cardiovascular outcomes in patients with type 2 diabetes and nephropathy[J].N Engl J Med，2001，345（12）：861-869.

[3] Molin L，Seraglia R，Lapolla A，et al.A comparison between MALDI-MS and CE-MS data for biomarker assessment in chronic kidney diseases[J].J Proteomics，2012，75（18）：5888-5897.

[4] Stepczynska A，Schanstra J P，Mischak H.Implementation of CE-MS-identified proteome-based biomarker panels in drug development and patient management[J].Bioanalysis，2016，8（5）：439-455.

[5] Nkuipou-Kenfack E，Duranton F，Gayrard N，et al.Assessment of metabolomic and proteomic biomarkers in detection and prognosis of progression of renal function in chronic kidney disease[J].PLoS One，2014，9（5）：e96955.

[6] Good D M，Zürbig P，Argiles A，et al.Naturally occurring human urinary peptides for use in diagnosis of chronic kidney disease[J].Molecular & Cellular Proteomics，2010，9（11）：2424-2437.

[7] Genovese F，Manresa A A，Leeming D J，et al.The extracellular matrix in the kidney： a source of novel non-invasive biomarkers of kidney fibrosis？[J].Fibrogenesis & Tissue Repair，2014，7（1）：4.

[8] Magalh?es P，Pejchinovski M，Markoska K，et al.Association of kidney fibrosis with urinary peptides： a path towards non-invasive liquid biopsies？[J].Sci Rep，2017，7（1）：16915.

[9] Rodriguez-Ortiz M E，Pontillo C，Rodriguez M，et al.Novel Urinary Biomarkers For Improved Prediction Of Progressive Egfr Loss In Early Chronic Kidney Disease Stages And In High Risk Individuals Without Chronic Kidney Disease[J].Sci Rep，2018，8（1）：15940.

[10] Pontillo C，Jacobs L，Staessen J A，et al.A urinary proteome-based classifier for the early detection of decline in glomerular filtration[J].Nephrol Dial Transplant，2017，32（9）：1510-1516.

[11] Critselis E，Lambers Heerspink H.Utility of the CKD273 peptide classifier in predicting chronic kidney disease progression[J].Nephrol Dial Transplant，2016，31（2）：249-254.

[12] Argiles A，Siwy J，Duranton F，et al.CKD273， a new proteomics classifier assessing CKD and its prognosis[J].PLoS One，2013，8（5）：e62837.

[13] Gu Y M，Thijs L，Liu Y P，et al.The urinary proteome as correlate and predictor of renal function in a population study[J].Nephrol Dial Transplant，2014， 29（12）： 2260-2268.

[14] Verbeke F，Siwy J，Van Biesen W，et al.The urinary proteomics classifier chronic kidney disease 273 predicts cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease[J].Nephrol Dial Transplant，2019：1-8.

[15] Perkins B A，Ficociello L H，Roshan B，et al.In patients with type 1 diabetes and new-onset microalbuminuria the development of advanced chronic kidney disease may not require progression to proteinuria[J].Kidney Int，2010，77（1）：57-64.

[16] Zurbig P，Jerums G，Hovind P，et al.Urinary proteomics for early diagnosis in diabetic nephropathy[J].Diabetes，2012，61（12）：3304-3313.

[17] Zurbig P，Mischak H，Menne J，et al.CKD273 Enables Efficient Prediction of Diabetic Nephropathy in Nonalbuminuric Patients[J].Diabetes Care，2019，42（1）：e4-e5.

[18] Chen C，Wang C，Hu C，et al.Normoalbuminuric diabetic kidney disease[J].Front Med，2017，11（3）：310-318.

[19] Currie G E，von Scholten B J，Mary S，et al.Urinary proteomics for prediction of mortality in patients with type 2 diabetes and microalbuminuria[J].Cardiovasc Diabetol，2018，17（1）：50.

[20] Fox C S，Matsushita K，Woodward M，et al.Associations of kidney disease measures with mortality and end-stage renal disease in individuals with and without diabetes： a meta-analysis[J].The Lancet，2012，380（9854）：1662-1673.

[21] Andersen S，Mischak H，Zürbig P，et al.Urinary proteome analysis enables assessment of renoprotective treatment in type 2 diabetic patients with microalbuminuria[J].BMC nephrology，2010，11（1）：29.

[22] Tofte N，Lindhardt M，Adamova K，et al.Characteristics of high- and low-risk individuals in the PRIORITY study： urinary proteomics and mineralocorticoid receptor antagonism for prevention of diabetic nephropathy in Type 2 diabetes[J].Diabet Med，2018，35（10）：1375-1382.

[23] Lindhardt M，Persson F，Zurbig P，et al.Urinary proteomics predict onset of microalbuminuria in normoalbuminuric type 2 diabetic patients， a sub-study of the DIRECT-Protect 2 study[J].Nephrol Dial Transplant，2017，32（11）：1866-1873.

[24] Konvalinka A，Batruch I，Tokar T，et al.Quantification of angiotensin II-regulated proteins in urine of patients with polycystic and other chronic kidney diseases by selected reaction monitoring[J].Clinical proteomics，2016，13（1）：16.

[25] Aggarwal A，Gupta R，Negi V，et al.Urinary haptoglobin， alpha-1 anti-chymotrypsin and retinol binding protein identified by proteomics as potential biomarkers for lupus nephritis[J].Clinical & Experimental Immunology，2017，188（2）：254-262.

[26] Nkuipou-Kenfack E，Zurbig P，Mischak H.The long path towards implementation of clinical proteomics： Exemplified based on CKD273[J].Proteomics Clin Appl，2017，11（5-6）.

（收稿日期：2019-12-24） （本文編輯：周亞杰）