綿羊Fsp27基因5

張偉 王世銀 高莉 徐夢思 王新華 甘尚權

摘要：【目的】明確綿羊脂肪特異蛋白27基因（Fsp27）5'端非編碼區（5'-UTR）g.16767527位點和g.16767779-16767780位點突變與其尾脂沉積能力的關聯性，為低脂肪綿羊品種選育提供理想的分子標記，提高低脂肪綿羊品種改良選育效率?！痉椒ā恳?個不同尾脂沉積能力的綿羊品種為研究對象，包括脂尾型綿羊品種阿勒泰羊，短脂尾型綿羊品種小尾寒羊和湖羊，長瘦尾型綿羊品種中國美利奴細毛羊和薩?？搜颍捎肞CR-SSCP結合基因測序對綿羊Fsp27基因5'-UTR區堿基突變情況進行檢測，并分析相關突變與綿羊尾脂沉積能力的關聯性?！窘Y果】綿羊Fsp27基因5'-UTR區g.16767527位點為C/A突變，在所檢測的綿羊群體中均存在3種基因型（CC、CA和AA），但在不同尾脂沉積能力綿羊品種群體中的基因型頻率存在明顯差異：阿勒泰羊群體中以CC基因型為主，基因型頻率為0.869;小尾寒羊和湖羊群體中以CA基因型為主，基因型頻率分別為0.698和0.628;中國美利奴細毛羊和薩?？搜蛉后w則以AA基因型為主，基因型頻率分別為0.616和0.833。g.16767527位點的基因型分布在阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群體中極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態（PHWE<0.01），在薩?？搜蛉后w中顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態（PHWE<0.05）。g.16767779-16767780位點為雙堿基突變，對應為GG/GG、GG/TC和TC/TC基因型;在尾脂沉積能力強的阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群體中，g.16767779-16767780位點以TC為優勢等位基因，對應的等位基因頻率分別為0.862、0.954和0.927;在尾脂沉積能力差的中國美利奴細毛羊和薩福克羊群體中則以GG等位基因為主，其等位基因頻率分別為0.980和0.983。這2個位點的突變均對綿羊Fsp27基因5'-UTR區二級結構產生明顯影響?！窘Y論】綿羊Fsp27基因5'-UTR區g.16767527位點的C/A突變和g.16767779-16767780位點的GG/TC突變與其尾脂沉積能力密切相關，可作為分子標記應用于低脂肪綿羊品種的輔助選育。

關鍵詞： 綿羊;Fsp27基因;5'-UTR區;堿基突變;尾脂沉積能力;關聯性

中圖分類號： S826.8? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）07-1511-09

Abstract：【Objective】To investigate the relationship between the g.16767527 site and g.16767779-16767780 sites mutation of fat specific protein 27 gene（Fsp27） 5' non-coding region（5'-UTR） and the tail fat deposition ability of sheep， find ideal molecular markers for low fat sheep breeding， and then improve the breeding efficiency of low fat sheep. 【Method】Here， five sheep breeds which had different fat deposition abilities were chosen， including the Altay sheep， which is a fat tail or nates sheep breed， small tail Han sheep and Hu sheep， which are short fat tail breeds， and Chinese Merino and Suffolk sheep， which are long thin tail breeds， and PCR-SSCP and gene sequencing were applied to detect the mutation in 5'-UTR of Fsp27 gene and investigated the relationship between the mutation sites and tail fat deposition in sheep. 【Result】The results showed that three genotypes（CC， CA and AA） of the C/A mutation at g.16767527 site in 5'-UTR of Fsp27 gene could be detected in all sheep population included in this research， but their genotype frequency were different in sheep breeds with different fat deposition abilities. The CC genotype was the major one in Altay sheep population， its genotype was 0.869; the CA genotype was the major one in Small Tail Han sheep and Hu sheep， the genotype were 0.698 and 0.628 respectively; but in Chinese Merino and Suffolk sheep， the AA was major genotype， the genotype were 0.616 and 0.833 respectively. The genotype distribution of g.16767527 site extremely significantly drifted Hardy-Weinberg equilibrium（PHWE<0.01） in Altay， Small Tail Han sheep and Hu sheep， and it significantly drifted Hardy-Weinberg equilibrium（PHWE<0.05） in Suffolk sheep population. At g.16767779-16767780 site， there were two mutated bases， and showed three different genotypes， GG/GG， GG/TC and TC/TC respectively. The TC was preponderance genotype at g.16767779-16767780 sites in Altay sheep， Small Tail Han sheep and Hu sheep population， which had a good ability to grow tail fat， and the genotype frequencies were 0.862， 0.954 and 0.927 respectively. But in Chinese Merion and Suffolk sheep population， which had poor tail fat deposition ability， the preponderance genotype was GG and genotype frequencies were 0.980 and 0.983 respectively. Further investigation showed that mutation at the two sites all obviously affected the secondary structure of Fsp27 gene? 5'-UTR. 【Conclusion】The C/A mutation at g.16767527 site and GG/TC mutation at g.16767779-16767780 site of Fsp27 gene 5'-UTR of sheep are highly correlated with their tail fat deposition ability， and may be good molecular markers that can be used to breed sheep breeds with low fat.

Key words： sheep（Ovis aries）; Fsp27 gene; 5'-UTR region; base mutation; tail fat deposition ability; relevance

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31860298， 31860639）; Open Project of State Key Laboratory of Sheep Genetic Improvement and Healthy Production（MYSKLKF201801）

0 引言

【研究意義】高寒地區綿羊利用夏秋季節牧草充足時期在其尾部沉積大量脂肪作為能量儲備，至冬季牧草匱乏時則通過分解尾脂為機體提供能量，順利度過冬季漫長的枯草期（甘尚權等，2013a）。在過去物質匱乏的年代，綿羊尾脂也是農牧民動物脂肪的重要來源，尾脂沉積能力強的綿羊品種也因此更受青睞。在自然選擇和人工選擇的共同作用下，高寒地區已形成很多尾脂沉積能力較強的綿羊品種（張偉等，2014），我國新疆北部地區大量養殖的阿勒泰羊就是典型代表。由于養殖條件的不斷改善，冬季枯草期已不再對高寒地區的綿羊產生明顯影響，且隨著人們生活水平的提高，高脂肪食物攝入對健康產生的危害已得到廣泛關注。在這種背景下，尾脂發達且胴體脂肪含量高的綿羊品種不再受到農牧民和消費者青睞。因此，如何在保持這類綿羊品種優良性狀的前提下對其進行改良選育，對提高脂尾型綿羊品種的市場適應性及促進低脂肪健康羊肉生產均具有重要意義。【前人研究進展】脂肪特異蛋白27（Fat specific protein 27，Fsp27）屬于CIDE（Cell death-inducing DEF45-like effector）家族成員，定位于脂滴表面和內質網內（Nian et al.，2010），在促進脂肪細胞的脂滴融合過程中發揮重要作用（潘洪彬等，2014，2015）。Fsp27可在脂滴—脂滴接觸點（LD contact site，LDCS）上介導小脂滴中的中性脂經LDCS向大脂滴轉移，進而形成更大的脂滴，若Fsp27基因被敲除，則無法完成上述過程（Gong et al.，2011）。Nishino等（2008）研究發現，敲除Fsp27基因后，小鼠的白色脂肪水解速率顯著升高，脂肪細胞中的大脂滴轉變成很多分散均勻的小脂滴。Xu等（2015）研究證實，正常情況下人類肝細胞中的Fsp27基因表達量很低，當其被激活且上調表達時，會促進肝細胞中的脂滴生長，最終導致脂肪肝發生。董維鵬等（2018）研究表明，在3T3-L1細胞中，若Fsp27基因表達量下調，則細胞中的甘油三酯含量顯著下降、甘油含量顯著上升，同時大脂滴的生成受抑制，細胞中分散有大量小脂滴。Fsp27肽鏈N端第1～130個氨基酸殘基構成的結構域僅在維持其構象中發揮作用，其C-端第131～239個氨基酸殘基在介導LDCS的中性脂轉移中發揮關鍵作用（Tamori et al.，2016），而第120～220個氨基酸殘基可與甘油三酯脂肪酶（Adipose triglyceride lipase，ATGL）相互作用，抑制ATGL的脂肪分解功能，進而引起甘油三酯沉積（Grahn et al.，2014）。此外，Fsp27可特異性抑制激素敏感脂肪酶（Hormone sensitive lipase，HSL）在脂滴表面的定位，進而抑制脂肪水解（李聰等，2014）。Fsp27基因表達水平與動物體內游離脂肪酸的含量密切相關，當脂肪酸水平升高時，Fsp27基因表達量相應上調，脂肪合成速度加快;而脂肪酸水平降低時，Fsp27基因表達量迅速下調，脂肪水解速度加快，從而使體內的脂肪酸保持在適當水平，以滿足機體的能量需求（Nian et al.，2010）。Fsp27在生物體內不穩定，其半衰期約1 h，說明其可快速響應體內脂肪酸的變化（Price et al.，2019）?！颈狙芯壳腥朦c】Fsp27基因在調控動物的脂肪沉積過程中發揮重要作用。本課題組前期在綿羊Fsp27基因5'端非編碼區（5'-UTR）檢測到大量的突變位點，但這些突變位點是否與綿羊的尾脂沉積能力相關尚有待進一步探究。【擬解決的關鍵問題】以5個不同尾脂沉積能力的綿羊品種為研究對象，對Fsp27基因5'-UTR區g.16767527位點和g.16767779-16767780位點突變與綿羊尾脂沉積能力的關聯性進行系統研究，以期為低脂肪綿羊品種選育提供理想的分子標記，提高低脂肪綿羊品種改良選育效率。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集

200份湖羊（短脂尾型）耳組織采自新疆生產建設兵團農六師鑫寶種羊場，210份薩?？搜颍ㄩL瘦尾型）耳組織采自新疆奇臺農場種羊場，200份中國美利奴細毛羊（長瘦尾型）耳組織采自新疆吉木薩爾縣三臺鎮細毛羊養殖基地，215份阿勒泰羊（脂尾型）耳組織樣品和165份小尾寒羊（短脂尾型）基因組樣品由新疆農墾科學院甘尚權研究員課題組饋贈，所有耳組織樣品均置于-20 ℃冰箱保存備用。

1. 2 DNA提取

不同綿羊品種耳組織樣品的基因組DNA均采用動物組織基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）進行提取，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，置于4 ℃冰箱保存備用。

1. 3 引物設計與合成

檢索Ensemble網站（http：//asia.ensembl.org/index.html），獲得綿羊Fsp27基因序列，然后與UCSC中（http：//genome.ucsc.edu/）收錄的綿羊基因組序列（Oar_v4.0，Nov. 2015）進行比對，截取包含5'-UTR的1000 bp序列設計2對引物，分別擴增Fsp27基因5'-UTR區（包含g.16767527位點和g.16767779-16767780位點），要求擴增片段控制在300 bp左右，以利于后續進行SSCP檢測。擴增引物（表1）采用Oligo 6.0進行設計，然后委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 4 不同綿羊品種Fsp27基因突變情況檢測及其尾脂沉積能力關聯性分析

以不同綿羊品種基因組DNA為模板，選用表1中的引物分別對Fsp27基因5'-UTR區進行PCR擴增，PCR反應體系25.0 ?L：DNA模板（100 ng/mL）1.0 ?L，10×PCR Buffer 2.5 ?L，dNTPs（10 mmol/L）2.0 ?L，上、下游引物（10 mmol/L）各0.5 ?L，Taq DNA聚合酶（2.5 U/L）0.5 ?L，加ddH2O補足至25.0 ?L。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，參照甘尚權等（2013b）的方法對其進行SSCP檢測，挑選不同帶型的PCR擴增產物進行測序，以確定其對應的突變位點，并分析相關突變與綿羊品種尾脂沉積能力的關聯性。

1. 5 統計分析

采用SPSS 19.0計算不同綿羊群體中Fsp27基因2個SNPs位點的基因型頻率及等位基因頻率，以卡方（χ2）檢驗分析各群體中的基因型是否處于Hardy-Weinberg平衡狀態（張偉等，2016）;使用RNAstructure 5.6分析不同位點突變對Fsp27基因5'-UTR二級結構的影響，并通過能值△G變化比較不同構象的穩定性。

2 結果與分析

2. 1 綿羊Fsp27基因5'-UTR區的PCR擴增結果

PCR擴增綿羊Fsp27基因5'-UTR區g.16767527位點和g.16767779-16767780位點所在區域，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測均獲得清晰明亮的單一條帶（圖1），未見明顯雜帶，且擴增片段大小與預期結果相符，說明PCR擴增體系具有良好的特異性和較高的擴增效率，為后續進行SSCP檢測提供了可靠保障。

2. 2 綿羊Fsp27基因5'-UTR區g.16767527位點突變與綿羊尾脂沉積能力的關聯性

使用Fsp27P1U和Fsp27P1L引物分別擴增不同尾脂沉積能力綿羊品種的基因組，PCR擴增產物經SSCP檢測，共獲得3種帶型（圖2-A）;對不同帶型對應的PCR擴增產物進行測序分析，可確認其分別為CC、CA和AA基因型（圖2-B），說明g.16767527位點在所檢測的綿羊群體中均存在3種基因型。

在5個不同尾脂沉積能力綿羊品種群體中均能檢測到綿羊Fsp27基因5'-UTR區g.16767527位點，但其基因型頻率存在明顯差異（表2），且與尾脂沉積能力具有明顯的關聯性。在脂尾型的阿勒泰羊群體中，CC基因型頻率為0.869，CA和AA基因型頻率分別為0.094和0.038;在短脂尾型的小尾寒羊和湖羊群體中以CA基因型為主，基因型頻率分別為0.698和0.628;在長瘦尾型的中國美利奴細毛羊和薩?？搜蛉后w中則以AA基因型為主，基因型頻率分別為0.616和0.833?？ǚ綑z驗結果顯示，g.16767527C>A位點的基因型分布在阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群體中極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態（PHWE<0.01），在薩?？搜蛉后w中顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態（PHWE<0.05）。

2. 3 綿羊Fsp27基因5'-UTR區g.16767779-16767780位點突變與綿羊尾脂沉積能力的關聯性

使用Fsp27P2U和Fsp27P2L引物分別擴增不同尾脂沉積能力綿羊品種的基因組，對PCR擴增產物進行SSCP檢測，也獲得3種帶型（圖3-A）;對不同帶型對應的PCR擴增產物進行測序分析，發現該位點為雙堿基突變，分別對應為GG/GG、GG/TC和TC/TC基因型（圖3-B）。此外，在檢測綿羊群體中該雙堿基突變存在明顯的連鎖遺傳，即G等位基因和G等位基因存在連鎖，T等位基因和C等位基因存在連鎖。

進一步分析g.16767779-16767780位點在不同尾脂沉積能力綿羊品種群體中的分布情況，結果表明該位點與綿羊的尾脂沉積能力存在明顯關聯性（表3）。在尾脂沉積能力強的阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群體中，g.16767779-16767780位點以TC為優勢等位基因，對應的等位基因頻率分別為0.862、0.954和0.927;在尾脂沉積能力差的中國美利奴細毛羊和薩?？搜蛉后w中則以GG等位基因為主，其等位基因頻率分別為0.980和0.983。

2. 4 位點突變對綿羊Fsp27基因5'-UTR二級結構的影響

為進一步了解g.16767527位點和g.16767779-16767780位點突變對綿羊Fsp27基因5'-UTR二級結構的影響，采用RNAstructure 5.6對不同基因型的5'-UTR二級結構進行預測，取自由能最低的預測結果進行比較，結果（圖4和圖5）發現這2個SNPs位點的突變均對綿羊Fsp27基因5'-UTR二級結構產生明顯影響。由于綿羊Fsp27基因的5'-UTR與翻譯起始調控、穩定性、剪切加工及細胞內的運輸和定位等過程密切相關，若堿基突變造成其二級結構改變，則可能對上述過程產生影響，致使細胞中Fsp27基因的編碼蛋白水平發生變化，進而影響其參與調控的生物學過程。

3 討論

Fsp27定位于脂肪細胞的脂滴表面和內質網內（Nian et al.，2010;許祥等，2020），其對脂肪沉積的調控過程已基本闡明，主要通過以下途徑促進脂肪沉積：（1）通過LDCS介導小脂滴中的中性脂肪向大脂滴轉移，進而形成一個更大的脂滴（Gong et al.，2011）;（2）Fsp27可特異性抑制HSL在脂滴表面的定位，HSL是脂肪水解過程中的關鍵水解酶，若HSL無法結合到脂滴上，則無法參與脂肪水解，進而導致脂肪水解受到影響（李聰等，2014）。Fsp27基因在細胞中的表達量與脂肪酸含量密切相關，但Fsp27不穩定，在生物體內的半衰期約1 h，因此其蛋白水平可快速響應細胞內脂肪酸含量的變化（Price et al.，2019）。當脂肪酸水平升高時，Fsp27基因表達量上調，脂肪水解被抑制;而脂肪酸不足時，Fsp27基因表達量下調，脂肪水解速率加快，促使機體的脂肪酸水平和能量供應保持在動態平衡狀態（Nian et al.，2010）。可見，脂肪細胞中Fsp27基因的表達量對其生物學功能正常發揮至關重要。

在細胞質中，單鏈mRNA均通過鏈內堿基配對而折疊成具有頸環結構的二級結構，而這種結構特點通常是核糖體結合及核酸內切酶識別等生物學過程的重要特征（王琛，2015;李瑞芳等，2018;常衛東等，2019）。由于mRNA的5'-UTR與翻譯起始調控、穩定性、剪切加工及細胞內的運輸和定位等過程密切相關（邢光東等，2008;高飛，2012），若5'-UTR發生堿基突變而影響其二級結構，勢必對其參與調控的信號通路產生影響，進而影響所調控的相關性狀。雖然至今未見綿羊Fsp27基因5'-UTR區堿基突變對其生物學功能產生影響的相關報道，但Curi等（2009）對瘤牛及其與黃牛雜交后代的研究結果表明，鈣調蛋白抑制蛋白（Calpastatin，CAST）基因5'-UTR區的Ddel多態位點與牛肉的剪切值（SF）及肌原纖維斷裂指數（MFI）相關;秦立紅等（2010）也研究表明，公牛雄激素受體基因5'-UTR區的T/G突變與其精子密度顯著相關;鄒輝等（2019）在努比亞山羊骨形態發生蛋白受體-IB（BMPR-IB）基因5'-UTR區檢測到A/G突變，其關聯分析結果表明該突變位點與努比亞山羊繁殖性能相關，表現為GG基因型母羊的產羔數和子代平均初生重較AA基因型母羊均有所減少。本研究通過對不同尾脂沉積能力綿羊品種Fsp27基因5'-UTR區的堿基突變進行系統分析，結果發現g.16767527位點的C/A突變和g.16767779-16767780位點的GG/TC突變均與綿羊尾脂沉積能力密切相關，具體表現為g.16767527位點為C等位基因和g.16767779-16767780位點為TC等位基因的綿羊品種尾脂沉積能力均明顯增強。此外，g.16767527位點和g.16767779-16767780位點的突變均對綿羊Fsp27基因5'-UTR區二級結構產生明顯影響，且由于這2個突變位點與綿羊尾脂沉積能力密切相關，故推測這種二級結構的改變可能對mRNA穩定性、轉運和翻譯效率產生影響，進而影響脂肪細胞中Fsp27基因的表達水平，最終造成綿羊尾脂沉積能力差異。鑒于此，今后應對不同基因型綿羊個體尾脂組織中的Fsp27基因表達水平進行定量分析，進一步揭示這2個突變位點的生物學功能。

脂肪代謝關系到機體能量供應，且一定是通過復雜的調控網絡進行精確控制，絕非1～2個基因或SNP位點就能闡述清楚。不同綿羊品種的尾脂沉積能力差異非常明顯，為研究脂肪代謝調控機制提供了很好的素材。本研究選用的阿勒泰羊屬于脂尾（脂臀）型綿羊品種（趙倩君等，2010），沉積尾部脂肪能力非常強，其尾脂重量可達十幾公斤;湖羊和小尾寒羊屬于短脂尾型綿羊品種，其尾脂沉積能力相對較弱（鞏元芳等，2002;王凱等，2013）;薩?？搜蚝图毭騽t屬于長瘦尾綿羊品種，其尾脂沉積能力最差。此外，這5個綿羊品種地域間隔較遠，進行基因交流的可能性較小。本課題組前期曾對阿勒泰羊、小尾寒羊、湖羊、薩?？搜蚝椭袊览毭虻?個綿羊品種的脂肪沉積相關基因突變情況進行系統研究，發現了大量與尾脂沉積能力相關的SNPs位點（甘尚權等，2013b;王世銀等，2013;張偉等，2013），綜合本研究的相關數據，后期將對這些數據進行深度分析，進而為低脂肪綿羊品種選育提供理想的分子標記。

4 結論

綿羊Fsp27基因5'-UTR區g.16767527位點的C/A突變和g.16767779-16767780位點的GG/TC突變與其尾脂沉積能力密切相關，可作為分子標記應用于低脂肪綿羊品種的輔助選育。

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（責任編輯 蘭宗寶）