柚皮素通過下調RhoA/ROCK信號通路改善糖尿病腎病小鼠腎纖維化

謝發江，冉茂霞，馮 健，李 燕，李家富，鄧 莉

1達州市中心醫院心血管內科；2達州市中心醫院腎病內科，達州 635000；3西南醫科大學附屬醫院心血管內科；4西南醫科大學附屬醫院風濕免疫科，瀘州 646000

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的微血管并發癥，也是終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)最常見的病因[1]。DN目前發病機制復雜，涉及腎臟血流動力學改變、缺血、氧化應激、炎癥激活、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)激活等方面導致腎臟纖維化，最終累及腎臟功能。及時阻斷腎臟纖維化，能夠有效防止DN進展為ESRD[2]。

RhoA/ROCK信號通路的過度激活介導多種疾病包括DN在內的纖維化過程，并且法舒地爾為代表的ROCK阻斷劑，已經顯示了良好的抗DN腎纖維化作用[3]。柚皮素(naringenin，NRG)是從柑橘類植物中提純出的一種具有抗心律失常、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗纖維化、抗病毒、抗腫瘤等多種藥效的黃酮類化合物，被廣泛用于體內外研究[4]。而關于柚皮素在DN中作用，目前研究較少，因此本研究通過復制DN小鼠模型，予柚皮素處理后觀察DN腎纖維化的進展，同時我們設立法舒地爾作為陽性對照組，以期進一步探討柚皮素對RhoA/ROCK信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、藥品與試劑

1.1.1 動物

健康雄性SPF級6～8周齡C57BL/6小鼠32只，體重20±1.5 g，購自成都達碩實驗動物有限公司。動物許可證號：SCXK(川)2015-030。實驗期間進食普通飼料，自由飲水，12 h光照維持晝夜循環，室溫控制在25±1 ℃。

1.1.2 藥物及試劑

STZ購自美國Sigma公司(貨號S8050)；柚皮素標準品購自上海思域化工科技有限公司(批號JD8051003)；鹽酸法舒地爾注射液購自天津紅日藥業股份有限公司(批準文號：國藥準字H20040356)；抗RhoA(貨號ab187027)、ROCK1(貨號ab45171)、ROCK2(貨號ab71598)、層粘連蛋白(laminin，LN)(貨號ab11575)、纖連蛋白(fibronectin，FN)(貨號ab2413)、GAPDH(貨號ab37168)抗體均購自英國Abcam公司；抗MYPT1(貨號2643)、p-MYPT1 Thr853(貨號4563)抗體均購自美國CST公司；抗I型膠原蛋白(type-I collagen，Col1)(貨號AF7001)、III型膠原蛋白(type-III collagen，Col3)(貨號AF0136)抗體均購自美國Affbiotech公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號AS1086)購自武漢阿斯本生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器

BX53型光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；RM2016轉輪式切片機(德國LEICA公司)；BMJ-Ⅲ型包埋機、TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀，均為常州市中威電子儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；LiDE110型掃描儀(日本Canon公司)；Advia 2400型全自動生化分析儀(德國Siemens公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組、模型復制及給藥方法

C57BL/6小鼠適應性喂養1周，按隨機數表法分成正常組(NS組)、模型組(DN組)、柚皮素組(D+N組)、法舒地爾組(D+H組)，每組8只。DN組、D+N組、D+H組小鼠禁食12 h后腹腔注射1% STZ 80 mg/(kg·d)，NS組、DN組予等體積檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射，連續5天，每天1次，2周后斷尾取血測得隨機血糖大于16.7 mmol/L建立1型糖尿病小鼠模型，繼續喂養4周測定24 h尿蛋白定量(24-hour urinary protein quantity，24 h Upro)大于造模前2倍則視為DN模型復制成功，成模后D+N組予生理鹽水配制的柚皮素50 mg/(kg·d)混懸液灌胃[5]，D+H組予生理鹽水稀釋的鹽酸法舒地爾注射液40 mg/(kg·d)腹腔注射[3]，NS組、DN組等予體積生理鹽水灌胃，連續12周。代謝籠收集小鼠24 h尿液，測定24 h Upro，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后留取血清測定血肌酐(serum creatinine，Scr)，處死小鼠，取腎臟組織將其縱向對半切開，部分用4%多聚甲醛固定后制作成厚4 μm石蠟切片，部分凍存于-80 ℃冰箱，用于Western blot檢測。

1.2.2 24 h Upro及Scr的測定

將血液及尿液標本，離心，取上清液，采用全自動生化分析儀檢測24 h Upro及Scr。

1.2.3 腎臟組織病理學觀察

分別選取各組石蠟切片，脫蠟后行HE及Masson染色，于光鏡下觀察拍照。

1.2.4 免疫組化觀察腎臟組織中RhoA、ROCK1、ROCK2、Col1、Col3的水平

選取各組切片脫蠟后浸入檸檬酸鹽緩沖液并予高火加熱至沸騰后斷電5 min，再加熱1次，冷卻后予PBS洗5 min(2次，進行抗原修復。滴加山羊血清室溫封閉20 min。分別加入抗RhoA(1∶100)、ROCK1(1∶150)、ROCK2(1∶150)、Col1(1∶200)、Col3(1∶100)抗體，4 ℃孵育過夜，滴加 II 抗后繼續37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min×3次，DAB顯色后蘇木素復染，封片觀察。在100倍鏡下隨機選取5個不同視野200倍放大，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定該視野平均光密度(mean density，MD)，MD=全部圖像的光密度(integrated optical density，IOD)/面積(area)，將5張圖像MD的平均數視為每例樣本的MD，再進行統計分析。

1.2.5 Western blot測定RhoA、ROCK1、ROCK2、p-MYPT1、LN、FN的蛋白水平

取凍存腎臟組織37 ℃水浴解凍后，按質量體積比1∶10加入RIPA 裂解液，研磨組織后于碎冰上裂解30 min，取裂解液，4 ℃、12 000 rpm離心5 min，收集上清液，按試劑盒說明書測定蛋白濃度。根據所需樣本體積，以4∶1比例加入5×loding buffer，混勻后沸水浴95 ℃ 5 min使蛋白變性。配制8%、10%分離膠和5%濃縮膠，按蛋白量50 μg上樣，進行電泳分離，轉PVDF膜，經5% BSA液室溫封閉1.5 h后，根據抗體說明書加入稀釋后的I抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜 5 min×3次，加入II抗(1∶10 000)中，室溫孵育2 h，TBST洗膜 10 min(4次，ECL(A∶B=1∶1)顯色，膠片掃描存檔，AlphaEaseFC軟件進行條帶分析。

1.3 統計學處理方法

2 結果

2.1 12周末各組小鼠24 h Upro、Scr、血糖、體重變化

與NS組相比，DN組24 h Upro、Scr升高(P<0.05)；與DN組相比，D+N組、D+H組24 h Upro、Scr降低(P<0.05)，血糖、體重差異無統計學意義(P>0.05)；D+N組與D+H組24 h Upro、Scr、血糖、體重的差異無統計學顯著性(P>0.05)(見圖1)。

圖1 12周末各組小鼠24 h Upro、Scr、血糖、體重的變化Fig.1 The 24 h Upro,Scr,blood glucose and body weight of the mice were detected at the end of 12 注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Note:*P<0.05 vs NS group;#P<0.05 vs DN group.

2.2 腎臟組織病理學觀察

各組小鼠腎臟HE及Masson染色觀察NS組腎小球、腎小管及系膜結構排列整齊，輪廓清楚，間質可見少許膠原纖維；DN組腎小球肥大，腎小管上皮細胞結構排列紊亂并且不同程度變性及壞死，系膜基質增多，間質可見大量膠原纖維；D+N組、D+H組腎小球、腎小管及系膜結構排列較整齊，輪廓大致清晰，間質可見少量膠原纖維。腎臟膠原容積分數比較，DN組較NS組的水平明顯升高(P<0.05)；與DN組比較，D+N組、D+H組的水平明顯降低(P<0.05)；D+N組與D+H組的水平差異無統計學顯著性(P>0.05)(見圖2)。

圖2 各組小鼠腎臟組織HE及MASSON染色Fig.2 The representative images of HE and Masson staining in each group under light microscope (×200) 注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Note:*P<0.05 vs NS group;#P<0.05 vs DN group.

2.3 免疫組化觀察腎臟組織中RhoA、ROCK1、ROCK2、Col1、Col3的水平

棕黃色顆粒為陽性反應。與NS組相比，DN組RhoA、ROCK1、ROCK2、Col1、Col3的水平升高(P<0.05)；與DN組比較，D+N組、D+H組RhoA、ROCK1、ROCK2、Col1、Col3的水平降低(P<0.05)；D+N組與D+H組RhoA、ROCK1、ROCK2、Col1、Col3的水平差異無統計學顯著性(P>0.05，見圖3)。

圖3 免疫組化觀察小鼠腎臟組織RhoA、ROCK1、ROCK2、Col1、Col3蛋白水平變化Fig.3 Immunohistochemical identification of protein expression of RhoA,ROCK1,ROCK2,Col1 and Col3 in different group(×200) 注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Note:*P<0.05 vs NS group;#P<0.05 vs DN group.

2.4 Western blot測定RhoA、ROCK1、ROCK2、p-MYPT1 Thr853、LN、FN的蛋白水平

與NS組相比，DN組RhoA、ROCK1、ROCK2、p-MYPT1 Thr853、LN、FN的水平升高(P<0.05)；與DN組相比，D+N組、D+H組RhoA、ROCK1、ROCK2、p-MYPT1 Thr853、LN、FN的水平降低(P<0.05)；D+N組與D+H組RhoA、ROCK1、ROCK2、p-MYPT1 Thr853、LN、FN的水平差異無統計學顯著性(P>0.05，見圖4)。

圖4 各組小鼠腎臟組織RhoA、ROCK1、ROCK2、p-MYPT1 Thr853、LN、FN蛋白水平變化Fig.4 The protein levels of RhoA,ROCK1,ROCK2,p-MYPT1 Thr853,LN and FN in different groups determined by Western blot 注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Note:*P<0.05 vs NS group;#P<0.05 vs DN group.

3 結論

DN腎病早期病理改變以腎小球硬化、腎小動脈損害、腎小管退行性變為主，并逐漸出現腎臟纖維化，晚期出現大量蛋白尿及腎衰竭[6]。柚皮素為黃酮類化合物代表性藥物之一，文利等[5]發現柚皮素可能通過下調TGF-β1/smad信號通路減輕DN大鼠腎臟纖維化，保護腎臟功能。Ning等[7]進一步研究發現柚皮素上調let-7a的表達，后者負調節轉化生長因子-β1受體1(transforming growth factor-β1 receptor 1，TGFBR1)進而抑制TGF-β1/smad 信號通路進而治療DN。此外，柚皮素還可能通過下調氧化應激水平，抑制炎癥因子的表達及細胞凋亡等途徑延緩DN進展，保護腎臟功能[8]。本研究中，通過采用STZ腹腔注射建立1型糖尿病小鼠模型后繼續喂養4周以24 h Upro大于造模前2倍視為DN模型復制成功，成模后予柚皮素50 mg/(kg·d)灌胃12周，并設置法舒地爾40 mg/(kg·d)腹腔注射作為陽性對照組，檢測模型組小鼠血糖升高，體重減少，腎臟組織結果顯示Col1、Col3、LN、FN表達增加，病理切片也可見明顯腎纖維化，并伴有明顯蛋白尿及腎功能下降，而柚皮素和法舒地爾分別干預后Col1、Col3、LN、FN表達減少，腎纖維化減輕，蛋白尿及腎功能得到改善，血糖及體重較模型組無明顯變化，說明了柚皮素、法舒地爾能夠改善DN腎纖維化，且不影響體重及血糖。

RhoA為小分子三磷酸鳥苷(guanosinetriphosphate，GTP)結合蛋白中Ras超家族的一員。酪氨酸激酶和G蛋白偶聯受體能夠募集并激活RhoA的鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors，GEF)，從而使RhoA由GDP結合的非活化狀態轉換為GTP結合的活性狀態，RhoA扮演分子開關的角色實現兩種狀態之間的轉換，作用于其下游信號分子產生生物學效應[9]。Rho相關蛋白激酶(rho-associated protein kinase，ROCK)是第一個被發現的同時也是目前功能研究最為明確的RhoA下游效應分子。ROCK的相對分子質量約為160 kDa，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族系統。ROCK存在兩種亞型：ROCK1和ROCK2，二者基本結構包括3個主要的結構域：N端的具有催化作用的激酶域、中間包含Rho 結合域(rho binding domain，RBD)的卷曲螺旋結構區、C端富含半胱氨酸(cysteine-rich domain，CRD)的PH結構域。ROCK1和ROCK2 65%氨基酸序列是一致的，激酶域的同源性可達92%[10]。ROCK 在大多數組織中都有表達，但不同組織中存在異質性，ROCK1主要表達于肝、睪丸、脾、腎和肺等，ROCK2主要表達于大腦、骨骼肌、心臟等[11]。RhoA/ROCK組成的信號通路通過與下游底物肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)、MYPT-1、CPI-17、ERM等相互作用參與細胞增殖、粘附、遷移、凋亡等生理活動的調節[12]。在病理狀態下，RhoA/ROCK信號通路上調多種促纖維化因子的分泌，如血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、血管緊張素Ⅱ(angiotensin II，AngII)、內皮素-1(endothelin，ET-1)、單核細胞趨化因子-1(monocyte chemotactic factor，MCP-1)、白細胞介素-6(interleukin，IL-6)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)等的表達[13]。ROCK也可誘導核轉錄因子kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)的活化，而后者的激活又可上調腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-ɑ)、IL-1β等促纖維化因子的分泌[14]。法舒地爾是目前第一個也是唯一批準上市可用于臨床的ROCK抑制劑，因其強大的擴血管作用，而被廣泛應用于蛛網膜下腔出血、缺血性心臟疾病等血管痙攣疾病，其能夠有效結合ATP依賴的激酶結構域阻斷ROCK進而抑制RhoA/ROCK信號通路的信號轉導[15]。在DN領域，法舒地爾亦被廣泛研究，并且通過影響以下多種途徑改善DN：(1)抑制NF-κB、FN、TGF-β的活化，減弱炎癥反應，緩解腎小球硬化[16]；(2)促進足突細胞的形成[17]，恢復異常的收縮運動，減少腎小球濾過膜通透性及蛋白尿形成[18]；(3)抑制腎小管上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程，減弱腎間質纖維化[19]；(4)擴張腎臟血管網，改善腎臟血流動力學，減少腎臟損傷[20]。本研究中，與正常組相比，模型組小鼠腎臟組織中RhoA、ROCK1、ROCK2的表達顯著升高，MYPT1 Thr853磷酸化程度增加，ROCK活性增高；法舒地爾組與模型組相比腎臟組織中RhoA、ROCK1、ROCK2的表達顯著下降，MYPT1 Thr853磷酸化程度減低，ROCK活性減弱，并伴有尿蛋白減少和腎功能改善；與法舒地爾組相似，柚皮素組與模型組相比較，腎臟組織中RhoA、ROCK1、ROCK2的表達顯著下降，MYPT1 Thr853磷酸化程度減低，ROCK活性減弱，并伴有尿蛋白減少和腎功能改善，而法舒地爾組與柚皮素組二者各指標差異未見統計學顯著性，該實驗結果表明RhoA/ROCK信號通路參與DN小鼠腎纖維化的形成，柚皮素改善DN小鼠腎纖維化可能與下調RhoA/ROCK信號通路有關。

綜上所述，動物實驗研究提示柚皮素能夠顯著降低DN小鼠腎纖維化程度，其機制可能與下調RhoA/ROCK信號通路有關，但其具體機制及作用位點有待細胞分子水平的進一步深入研究。