龍膽苦苷對非酒精性脂肪肝TLR-4/NF-κB和AMPK/Nrf2通路的影響

許瓊梅，高 雅，李梓萌，韋日明，馬曉輝，晉 玲*，張可鋒*

1桂林醫學院藥學院，桂林 5410041；2甘肅中醫藥大學藥學院，蘭州 730000

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指排除酒精和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變為主要特征的臨床病理綜合征，與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和氧化應激關系密切[1,2]。隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，NAFLD在我國的發病率呈上升趨勢，遺傳、糖尿病、高脂飲食、運動缺乏等內外因素都能誘發NAFLD[3]。現代醫學認為，NAFLD由于氧化應激及胰島素抵抗二次或多重打擊引起的，這一理念被國內外學者廣泛認同[4]。因此抗炎抗氧化等經典策略可作為本病的基本治則。TLR-4/NF-κB信號通路是經典的炎癥通路，該通路是對各種刺激引起肝臟變化最常見的通路[5]。TLR-4的激發通過一系列信號轉導激活NF-κB，繼而促進炎癥因子釋放，最終誘導肝細胞壞死并激活炎癥級聯反應。抑制TLR-4/NF-κB信號通路的活化是減輕肝組織炎癥反應的關鍵通路，也是下調與氧化應激有關的炎性表達的標志。同時，AMPK/Nrf2信號通路在體內抵抗氧化應激和改善脂質沉積過程中發揮重要作用。Nrf2是細胞防御系統抵抗氧化應激的主要調節因子，有證據表明Nrf2的遺傳缺失與更嚴重的NAFLD相關[6]。AMPK是細胞能量穩態和炎癥的中心調節劑，能夠調節脂肪酸生物合成，并抑制氧化應激和炎癥反應[7]。由于Nrf2和AMPK在氧化應激和脂質代謝中的關鍵作用，該通路可作為治療肝臟脂質浸潤和炎癥的潛在治療靶標。同時，已有研究表明AMPK/Nrf2通路可能是調節非酒精性脂肪肝發展進程的關鍵通路[8]。

龍膽苦苷(gentiopicroside，GPS)是由龍膽科植物龍膽草中提取的裂環烯醚萜苷類[9,10]，藥理研究表明GPS具有抗炎鎮痛、抗氧化、清除自由基等臨床功效，其保肝利膽療效顯著[11]，然而其保肝機制尚未明確。許多研究顯示GPS在抗病原微生物、胃腸道、胰腺、心血管疾病甚至呼吸系統疾病與神經精神疾病等方面也有較大的應用潛力[12]。同時，GPS具有顯著抗氧化和保護肝臟的作用，并能促進膽汁分泌和其他生物活性。有報道表明GPS對化學物質和D-半乳糖胺/脂多糖誘導的肝損傷小鼠具有保護作用[13]。另外，GPS可通過AMPK-PPARα信號通路改善酒精性脂肪肝病癥狀，但是目前關于NAFLD模型中GPS與TLR-4/NF-κB、AMPK/Nrf2信號通路之間的關聯的研究尚未報道。故本實驗通過建立大鼠NAFLD模型，采用二甲雙胍作對照，初步研究GPS保護肝臟的作用及對TLR-4/NF-κB、AMPK/Nrf2信號通路的調控作用，為GPS用于臨床治療NAFLD提供依據。

1 材料與試劑

1.1 動物

雄性SD大鼠66只，體質量200 ± 20 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK(湘)2016-0002。所有大鼠均飼養在溫度22 ± 2 ℃、濕度45%～50%、12 h光照/暗循環的環境下，自由獲取食物和水，實驗前適應1周。

1.2 實驗藥物及試劑

GPS(南京道斯夫生物科技有限公司，純度>98%，批號：181116A)；高脂飼料(D12492，江蘇協同藥業生物工程有限公司)；谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、甘油三酯(TG)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(Elabscience公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(南通市碧云天生物技術研究所)；NF-κBp-p65、NF-κBp65、AMPK、p-AMPK抗體、Nrf2抗體(美國CST)；TLR-4抗體(英國Abcam)；β-actin單抗(天錫傲銳東源生物科技有限公司)；辣根酶標志的二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)；Super ECL Plus超敏發光液(北京普利萊基因科技有限公司)。

1.3 儀器

H2050R型臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機廠)；Epoch型全波長酶標儀(美國Bio-Tek公司)；AUW220D型半微量電子天平(日本島津公司)；O1ympus BX51型顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；THZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩器(太倉市實驗設備廠)；垂直電泳儀、轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；全自動化學發光圖像分析系統(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 分組及處理

66只SD大鼠隨機均分為兩組：正常組(n=13)和高脂組(n=53)。正常組喂普通飼料，高脂組喂高脂飼料。喂養8周后，兩組各隨機抽取3只小鼠進行病理檢查，評估NAFLD模型是否成功[14]。確定模型成功后，高脂組隨機均分為模型組、二甲雙胍組(200 mg/kg)和GPS高、中、低劑量(120、60、30 mg/kg)組，每組10只。模型組繼續喂高脂飼料，各用藥組在喂高脂飼料的同時灌胃相應劑量的藥物，正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，每天1次，共6周。14周末，禁食不禁水16 h，摘除眼球取血，收集肝臟，肝左葉置于4%多聚甲醛中固定，肝右葉-80 ℃保存。

2.2 血清指標檢測

靜置血液樣本2 h后置于高速冷凍離心機4 500 rpm，4 ℃離心15 min，收集血清。嚴格按照試劑盒說明書步驟測定血清中ALT、AST、SOD、GSH-Px、MDA、TC、TG、LDL-C、HDL-C的活性或含量。

2.3 胰島素抵抗情況

葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖(FBG)，ELISA法檢測血清空腹胰島素(FINS)含量，胰島素抵抗指數按穩態胰島素評價指數(HOMA-IR)計算：HOMA-IR = FINS×FBG/22.5。

2.4 肝組織指標檢測

各取相同位置肝臟組織100 mg，加入磷酸鹽緩沖液研磨制成10%(W/V)肝組織勻漿，根據ELISA試劑盒說明書測定肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

2.5 蛋白質印跡法(Western blot)檢測肝組織中AMPK、p-AMPK、Nrf2、NF-κBp-p65、NF-κBp65、TLR-4蛋白表達水平

稱取各組大鼠肝葉相同部位約60 mg置于勻漿器中，加入RIPA裂解液于冰上研磨制成勻漿，離心后吸取上清液，嚴格按照BCA法測定蛋白濃度并進行定量，煮沸后使其變性，貯存于-20 ℃冰箱中待用。制備電泳膠(10%的分離膠和5%的濃縮膠)，用移液槍將變性蛋白和Marker加入上樣孔，進行SDS-PAGE電泳(濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓120 V)分離蛋白，于冰浴中300 mA、70 min條件下轉膜，將蛋白轉至PVDF膜，再用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，TBST洗滌3次后加入一抗4 ℃孵育過夜；次日，二抗孵育2 h，ECL化學發光法顯色，全自動化學發光系統顯影，Quantity One 4.6軟件分析蛋白灰度值，并以β-actin為內參，計算各組AMPK、p-AMPK、Nrf2、NF-κBp-p65、NF-κBp65、TLR-4蛋白的相對表達量。

2.6 肝組織病理學檢查

根據油紅O染色方法，將肝臟冰凍切片，60%異丙醇浸洗2 min，油紅O工作液染色，蘇木精復染，甘油明膠封片。封片后光學顯微鏡下觀察并拍攝肝臟脂質沉積情況。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 GPS對NAFLD大鼠血清中ALT、AST的影響

與正常組相比，模型組中的ALT和AST活性明顯增高(P<0.01)。與模型組相比，二甲雙胍組和GPS各劑量組中ALT和AST活性均明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01或P<0.05)，表明GPS對肝臟具有一定的保護作用，結果見表1。

表1 GPS對NAFLD大鼠血清中ALT、AST的影響Table 1 Effect on the serum ALT and AST of

3.2 GPS對NAFLD大鼠血清中MDA、SOD、GSH-Px的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中MDA含量明顯升高(P<0.01)，SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍組和GPS各劑量組能一定程度地降低NAFLD大鼠血清中MDA的含量(P<0.05或P<0.01)，且提高SOD、GSH-Px的活性，差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，表明GPS保護肝臟可能與抑制氧化應激有關，結果見表2。

表2 GPS對SOD、GSH-Px和MDA的影響Table 2 Effect of GPS on the serum SOD,GSH-Px and

3.3 GPS對NAFLD大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響

與正常組相比，模型組中的TC、TG、LDL-C水平明顯增高，而HDL-C明顯降低(P<0.01)，表明本實驗建立的NAFLD動物模型成功。與模型組相比，二甲雙胍組和GPS各劑量組均能不同程度地降低NAFLD大鼠的TC、TG和LDL-C水平，且提高HDL-C水平(P<0.05或P<0.01)，說明GPS能改善NAFLD大鼠的脂質代謝從而保護肝臟。結果見表3。

表3 GPS對血清中TC、LDL-C、HDL-C、TG的影響Table 3 Effect of GPS on the serum TC,LDL-C,HDL-C and

3.4 GPS對NAFLD大鼠胰島素抵抗水平的影響

與正常組相比，模型組中的FINS、FBG、HOMA-IR水平明顯增高(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍組和GPS高、中劑量組FBG、FINS、HOMA-IR水平顯著降低(P<0.01)，GPS低劑量組FBG水平顯著降低(P<0.01)，FINS、HOMA-IR水平無統計學差異(P>0.05)，表明GPS能改善NAFLD大鼠的胰島素抵抗水平。結果見表4。

表4 GPS對胰島素抵抗的影響Table 4 The of GPS effects on insulin

3.5 GPS對NAFLD大鼠肝臟中TNF-α、IL-1β和IL-6的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍和GPS各劑量組都能有效抑制NAFLD大鼠肝臟TNF-α、IL-1β和IL-6水平的升高(P<0.01或P<0.05)，表明GPS能抑制炎癥反應從而保護肝臟。結果見表5。

表5 GPS對肝組織TNF-α、IL-1β和IL-6的影響Table 5 Effect of GPS on the hepatic TNF-α,IL-1β and

3.6 GPS對NAFLD大鼠肝臟中TLR-4/NF-κB及AMPK/Nrf2通路蛋白表達水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中NF-κBp-p65、TLR-4水平顯著升高而AMPK、Nrf2水平明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍和GPS各劑量組都能有效抑制NAFLD大鼠肝臟NF-κBp-p65與TLR-4水平的升高，同時上調AMPK和Nrf2的表達水平(P<0.01或P<0.05)，表明GPS能通過調控TLR-4/NF-κB及AMPK/Nrf2通路從而保護肝臟，結果見表6。

圖1 GPS對TLR-4/NF-κB及AMPK/Nrf2的影響Fig.1 Effect of GPS on TLR-4/NF-κB and AMPK/Nrf2注：A：正常組；B：模型組；C：二甲雙胍組；D：GPS低劑量組；E：GPS中劑量組；F：GPS高劑量組；下同。Note:A:Normal group;B:Model group;C:Metformin group;D:GPS-low dose group;E:GPS-medium dose group;F:GPS-high dose group;The same below.

3.7 GPS對大鼠肝組織病理形態的影響

油紅O染色結果顯示，正常組(圖2A)大鼠無明顯脂滴和炎性浸潤，模型組(圖2B)大鼠肝臟出現大面積的紅色脂肪滴，有明顯炎性細胞浸潤。二甲雙胍組(圖2C)和GPS各劑量組(圖2D-F)肝臟紅色脂滴明顯減少，炎性細胞數量明顯減少。

圖2 肝組織油紅O染色(200×)Fig.2 Liver tissue oil red O staining (200×)

4 討論

近年來NAFLD的發病率呈明顯的上升趨勢，已成為慢性肝病及肝功能異常的主要病因之一[15]。目前用于治療NAFLD的相關藥物多數需要通過肝臟代謝，在治療NAFLD的同時也加重了肝臟的負擔，而且藥物對NAFLD治療效果有限，尚未發現特異性較強的藥物[16]，因此，尋找到療效確切且副作用小的藥物來治療NAFLD有較大的現實意義。

高脂飲食能引起血清中游離脂肪酸(FFA)增加，FFA在體內不斷積累引起肝損傷，細胞膜通透性增高，導致細胞中ALT、AST溢出進入血液[17]。模型組血清中ALT、AST的活性升高，伴隨著TC、TG、LDL-C含量上升，HDL-C含量下降，表明本實驗成功建立NAFLD模型。研究結果顯示，GPS有效改善NAFLD，并對轉氨酶和血脂有調節作用，對肝臟起保護作用。

NAFLD的具體發病機制尚不清楚，目前“多重平行打擊”發病機理已被廣泛接受。炎癥、氧化應激和胰島素抵抗等多種因素共同導致了NAFLD的發生與進展[18,19]。IR為中心引起的肝臟脂肪浸潤產生大量FFA，機體氧化途徑無法處理過量FFA則會導致TG增多，進而引起脂肪堆積誘發脂肪變性[20]。同時FFA增多刺激肝臟枯否細胞分泌炎癥反應調節因子TNF-α、IL-1β和IL-6，促進炎癥的發生，導致肝細胞炎性浸潤、壞死及纖維化的發生[21]。肝臟發生炎癥反應時，TLR-4與其配體結合激活NF-κB，從而引起一系列的炎性因子的合成和釋放，誘發機體產生炎癥反應[22]。本實驗結果表明，GPS高、中、低劑量組均能降低胰島素抵抗指數、TG、TC、LDL-C及炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，提高HDL-C水平，能夠有效抑制TLR-4及NF-κB信號通路，其中GPS高劑量組改善情況最明顯，提示GPS可能通過抑制炎癥反應、調節脂質代謝，調控TLR-4/NF-κB通路保護肝臟。

氧化應激是非酒精性脂肪肝病公認的損傷因素之一，肝細胞內富含線粒體有利于氧化FFA，為細胞提供能量的同時還會產生大量活性氧自由基[23]。機體的抗氧化防御系統可以通過抑制自由基產生、清除自由基、修復損傷及誘導抗氧化酶發揮保護作用，SOD和GSH-Px為重要的抗氧化酶，能夠有效清除自由基，抑制脂質過氧化反應物形成，起到保護機體的作用[24]。MDA為自由基參與脂質過氧化反應的終產物，其異常表達可嚴重破壞細胞膜的結構，引起細胞腫脹、壞死[25]。AMPK的激活可促進下游分子Nrf2的細胞核轉位，上調Nrf2的表達[26]。Nrf2通過調節因子發揮抗炎、抗氧化作用，介導下游多種抗氧化蛋白和酶如HO-1減輕肝臟氧化應激[27]。本研究結果表明，與模型組比較，GPS各劑量組可明顯增強SOD、GSH-Px活性并降低MDA含量，同時顯著增強p-AMPK、Nrf2蛋白表達水平，提示GPS可能激活AMPK/Nrf2信號通路，進而抑制氧化應激從而達到保肝作用。

綜上所述，GPS可有效改善NAFLD大鼠損傷狀況，調節胰島素抵抗情況，抑制氧化應激水平和炎癥反應，調控TLR-4/NF-κB和AMPK/Nrf2信號通路，為臨床應用提供新策略。