千里香中黃酮類成分的分離鑒定及抗氧化活性研究

向方桃，陳封政，陳建明，田 沖，楊孝蓉，李書華*

1樂山師范學院附屬醫院；2樂山師范學院 樂山特色農產品藥用成分研發工程中心，樂山 614000；3固態發酵資源利用四川省重點實驗室，宜賓 644000；4成都格純生物醫藥有限公司，成都 610000

千里香(Murrayapanaculata(L.) Jack)為蕓香科九里香屬植物，主要分布于我國南方等地。九里香屬在我國有6種及2個變種[1]，1978年植物分類學家黃成就將M.panaculata(L.) Jack的中文名稱由九里香更名為千里香[2]。2015版《中國藥典》收載的九里香為千里香(M.panaculata(L.) Jack)和九里香(M.exoticaL.)的干燥葉和帶葉嫩枝，其主要功能為行氣止痛，活血化瘀[3]。藥典里對九里香僅有性狀鑒別、顯微鑒別以及水分和總灰分檢查，缺少成分鑒別和有效成分的含量測定。國內外對九里香的研究報道較多，但仔細分析發現這些文獻研究的品種多為九里香(M.exoticaL.)，主要側重于九里香的提取物的生理活性研究：抑菌、抗炎、殺蟲、抗生育、消炎、鎮痛等藥理作用[4-6]以及成分分析、分離與鑒定[7,8]。目前國內外對千里香的研究主要集中揮發性成分分布[9]，精油的抑菌活性及成分分析[10]，氯仿萃取物提取物對家蠅成蟲、蘿卜蚜、椰心菜甲和斜紋夜蛾有殺滅作用和對香蕉、芒果的炭疽病的抑制作用[11]，醇提取物對稻瘟病病原菌的抑制作用[12]以及千里香的多甲氧基基黃酮成分分離與鑒定[13,14]等方面。

國內外對黃酮的抗氧化活性研究較多，黃酮抗氧化活性的機理是其酚羥基可能被氧化成羰基等因素，多甲氧基基黃酮由于酚羥基較少，其抗氧化活性比對應的黃酮弱[15]。

為了進一步闡明千里香的活性成分，我們對千里香枝葉的化學成分進行了分離鑒定，并對所得到的單體化合物進行了抗氧化活性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

旋轉蒸發儀YRE-501(鞏義市予華儀器有限責任公司)，電子天平FA1004(鶴壁市力科電子有限公司)，7200型可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司)，制備液相色譜SACID100 mm(成都格萊精密儀器有限公司)；Varian INOVA 400核磁共振譜儀。

薄層色譜硅膠GF254和柱色譜硅膠(300～400目，青島海洋化工有限公司產品)；維生素C(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)(百靈威科技有限公司)。

千里香，2018年7月購自安國冷背藥材有限公司，經樂山師范學院成英副教授鑒定為蕓香科九里香屬植物千里香(M.panaculata(L.) Jack)的干燥葉及嫩枝，標本保存于樂山師范學院樂山特色農產品藥用成分研發工程中心(20180701)。

1.2 方法

1.2.1 提取與分離

稱取10 kg千里香干燥葉及嫩枝，粉碎，平均分裝于2個50 L的塑料桶中，分別向每個桶中加入25 L乙酸乙酯，室溫浸泡5天后過濾，得到第一次浸提液。然后再次分別向每個桶中加入20 L乙酸乙酯，室溫浸泡5天，過濾，得到第二次浸提液。合并兩次浸提液，在50 ℃條件下減壓濃縮，得到流浸膏408 g。將流浸膏用乙酸乙酯溶解，上清液滴加于300 g 300～400目硅膠上，水浴揮干溶劑，得到吸附了樣品的硅膠。將2 500 g 300～400目硅膠濕法裝入玻璃層析柱中，然后將吸附了樣品的硅膠置于柱上端，以不同比例的石油醚：丙酮混合液(8∶1→1∶1)為洗脫液，得到6個部分。將每個部分通過制備液相分離，結合多次硅膠柱層析分離和重結晶純化，得到6個化合物：1(50 mg)、2(15 2mg)、3(95 mg)、4(30 mg)、5(110 mg)和6(36 mg)。

1.2.2 化合物抗氧化活性的測定

根據Hu等[15]的研究方法，以維生素C為陽性對照，采用DPPH自由基清除率檢測法，研究化合物的抗氧化活性。

抗氧化反應體系：用移液器分別準確取100 μL不同濃度的化合物或Vc溶液，3.90 mL 75 μmol/L的DPPH溶液，搖勻后放置于暗處30 min后，在517 nm波長處測定吸光度A0，同時測定100 μL化合物溶液+3.90 mL甲醇的吸光度A1以及3.90 mL 75 μmol/L的DPPH溶液+100 μL甲醇的吸光度A2。所有樣品均做三個重復，取平均值。按照下面公式計算化合物對DPPH自由基的清除率。

DPPH自由基的清除率=[1-(A0-A1)/A2]×100%

式中：A0=100 μL化合物溶液+3.90 mL DPPH溶液；A1=100 μL化合物溶液+3.90 mL甲醇的吸光度；A2=3.90 mL DPPH溶液+100 μL甲醇的吸光度。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

化合物1淡黃色粉末;10%硫酸-乙醇噴霧加熱后顯黃色。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.56(1H，d，J= 8.0 Hz，H-6′)，7.39(1H，s，H-2′)，6.96(1H，d，J= 8 Hz，H-5′)，6.59(1H，s，H-3)，6.41(1H，s，H-6)，3.98(3H，s，4′-OCH3)，3.95(6H，s，3′-OCH3，8-OCH3)，3.93(6H，s，5-OCH3，7-OCH3)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：178.2(C-4)，160.8(C-2)，156.6(C-7)，156.3(C-9)，151.9(C-5)，151.8(C-4′)，149.2(C-3′)，130.5(C-8)，123.9(C-1′)，119.7(C-6′)，112.2(C-5′)，108.7(C-10)，108.5(C-2′)，106.9(C-3)，92.4(C-6)，61.5(8-OCH3)，56.4(5-OCH3)，56.3(7-OCH3)，56.1(3′-OCH3)，56.0(4′-OCH3)。上述核磁數據與文獻[16]報道的5，7，8，3′，4′-五甲氧基黃酮基本一致。

化合物2淡黃色粉末;10%硫酸-乙醇噴霧加熱后顯黃色。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.17(2H，s，H-2′，6′)，6.64(1H，s，H-3)，6.44(1H，s，H-6)，4.01(3H，s，4′-OCH3)，3.99(3H，s，8-OCH3)，3.95(9H，s，3′-OCH3，5′-OCH3，5-OCH3)，3.92(3H，s，7-OCH3)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：177.9(C-4)，160.3(C-2)，156.7(C-7)，156.4(C-9)，153.5(C-3′)，153.5(C-5′)，151.9(C-5)，140.8(C-4′)，130.6(C-8)，126.7(C-1′)，108.8(C-10)，107.9(C-3)，103.2(C-2′)，103.2(C-6′)，92.5(C-6)，61.4(8-OCH3)，61.0(4′-OCH3)，56.6(5-OCH3)，56.3(7-OCH3)，56.2(3′-OCH3)，56.2(5′-OCH3)。上述核磁數據與文獻[17]報道的5，7，8，3′，4′，5′-六甲氧基黃酮基本一致。

化合物3淡黃色粉末;10%硫酸-乙醇噴霧加熱后顯黃色。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.08(2H，s，H-2′，6′)，6.64(1H，s，H-3)，6.58(1H，s，H-8)，6.44(1H，s，H-6)，3.97(3H，s，5-OCH3)，3.95(6H，s，3′-OCH3，5′-OCH3)，3.94(3H，s，7-OCH3)，3.92(3H，s，4′-OCH3)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：177.6(C-4)，164.1(C-7)，160.9(C-5)，160.5(C-2)，159.9(C-9)，153.5(C-3′)，153.5(C-5′)，140.8(C-4′)，126.8(C-1′)，109.2(C-10)，108.9(C-3)，103.4(C-2′)，103.4(C-6′)，96.2(C-6)，92.9(C-8)，61.1(4′-OCH3)，56.5(5-OCH3)，56.4(3′-OCH3)，56.4(5′-OCH3)，55.8(7-OCH3)。上述核磁數據與文獻[7]報道的5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黃酮基本一致。

化合物4淡黃色粉末;10%硫酸-乙醇噴霧加熱后顯黃色。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.08(2H，s，H-2′，6′)，6.81(1H，s，H-8)，6.70(1H，s，H-3)，4.00(3H，s，5-OCH3)，3.99(3H，s，7-OCH3)，3.94(6H，s，3′-OCH3，5′-OCH3)，3.92(6H，s，4′-OCH3，6-OCH3)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：177.6(C-4)，161.4(C-2)，158.0(C-7)，154.6(C-9)，153.6(C-3′)，153.6(C-5′)，152.5(C-5)，141.0(C-4′)，140.5(C-6)，126.7(C-1′)，112.7(C-10)，107.9(C-3)，103.5(C-2′)，103.5(C-6′)，96.3(C-8)，62.2(5-OCH3)，61.6(6-OCH3)，61.1(4′-OCH3)，56.4(3′-OCH3)，56.4(5′-OCH3)，56.4(7-OCH3)。上述核磁數據與文獻[18]報道的5，7，3′，4′，5′-六甲氧基黃酮基本一致。

化合物5淡黃色粉末;10%硫酸-乙醇噴霧加熱后顯黃色。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.54(1H，d，J= 8 Hz，H-6′)，7.35(1H，s，H-2′)，6.99(1H，d，J= 8 Hz，H-5′)，6.70(1H，s，H-8)，6.57(1H，s，H-3)，3.99(6H，s，3′-OCH3，4′-OCH3)，3.98(3H，s，7-OCH3)，3.92(3H，s，6-OCH3)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：182.7(C-4)，164.3(C-2)，158.9(C-7)，153.3(C-9)，152.9(C-4′)，152.4(C-5)，149.4(C-3′)，132.7(C-6)，123.6(C-1′)，120.2(C-6′)，111.2(C-5′)，108.8(C-2′)，106.0(C-10)，104.2(C-3)，90.7(C-8)，60.9(4′-OCH3)，56.4(6-OCH3)，56.1(3′-OCH3)，56.1(7-OCH3)。上述核磁數據與文獻[7]報道的5-羥基-6，7，3′，4′-四甲氧基黃酮基本一致。

化合物6淡黃色粉末;10%硫酸-乙醇噴霧加熱后顯黃色。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.61(1H，d，J= 8 Hz，H-6′)，7.44(1H，s，H-2′)，7.01(1H，d，J= 8 Hz，H-5′)，6.74(1H，s，H-3)，4.13(3H，s，7-OCH3)，3.99(9H，s，3′-OCH3，4′-OCH3，8-OCH3)，3.96(3H，s，6-OCH3)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：183.1(C-4)，164.4(C-2)，153.2(C-4′)，152.6(C-7)，149.9(C-9)，149.9(C-3′)，145.9(C-5)，136.7(C-6)，132.9(C-8)，123.5(C-6′)，120.3(C-1′)，111.3(C-5′)，108.8(C-2′)，106.8(C-10)，103.7(C-3)，62.1(6-OCH3)，61.8(7-OCH3)，61.2(6-OCH3)，56.2(3′-OCH3)，56.0(4′-OCH3)。上述核磁數據與文獻[7]報道的化合物5-羥基-6，7，8，3′，4′-五甲氧基黃酮基本一致。

2.2 化合物抗氧化活性的測定結果與分析

對從千里香中分得的6個化合物及千里香的乙酸乙酯提取物進行了抗氧化試驗，結果顯示千里香的乙酸乙酯提取物濃度為250 μg/mL時對DPPH自由基的清除率為15.26%，維生素C濃度為40 μM時對DPPH自由基的清除率為48.06%，6個化合物表現出不同程度的抗氧化作用(各化合物對DPPH自由基的清除率見圖1)，化合物1～4的抗氧化作用很弱，化合物5和6的有一定的抗氧化作用，但明顯弱于維生素C。通過結構分析，化合物5和化合物6均含有5位酚羥基，5位羥基與4位的羰基協同作用，形成一個六元環系來穩定和清除自由基[25]，故表現出一定的抗氧化活性；而化合物1～4則不含有酚羥基，缺少這種體系，故其抗氧化能力很弱。化合物1和3的抗氧化活性幾乎沒有差別，化合物2和4的抗氧化活性也很一致，但化合物2和4的抗氧化能力略強于化合物1和3。從上述結果可以看出，結構類似的多甲氧基黃酮在均無酚羥基存在的情況下，含甲氧基多的化合物抗氧化活性略強于含甲氧基少的化合物。

圖1 化合物對DPPH的清除曲線Fig.1 DPPH free radical scavenging abilities of compounds

3 結論

本文對千里香的乙酸乙酯提取物進行了分離純化，得到了6個多甲氧基黃酮，其中化合物1是首次從九里香屬植物里分離得到，也是首次從千里香植物里分離得到，豐富了千里香化合物的結構類型。化合物2和5填補了chembook資源平臺對照品的空白。對分離得到的6個多甲氧基黃酮進行了清除DPPH自由基試驗，結果顯示6個化合物均具有一定的抗氧化活性，其中含有5位酚羥基的多甲氧基黃酮的抗氧化活性明顯強于不含酚羥基的多甲氧基黃酮，對于結構類似均無酚羥基的多甲氧基黃酮，則含甲氧基多的化合物抗氧化活性略強于含甲氧基少的化合物。

通過本文的研究結合文獻[13,14]，可以看出千里香(M.panaculata(L.) Jack)一般不含有香豆素類化合物，而九里香(M.exoticaL.)[19,20]則富含香豆素類化合物，這從植物化學分類學上佐證了千里香和九里香的區別，以此推測《中國藥典》將千里香和九里香不加區別使用值得商榷。

致謝：感謝成都格純生物醫藥有限公司在分離工作中提供的部分設備和幫助。