五個不同產地絞股藍茶揮發物及香氣成分研究

王忠澤，楊宇涵，張紅霞，杜芝芝*

1中國科學院昆明植物研究所資源植物與生物技術重點實驗室 云南省野生資源植物研發重點實驗室，昆明 650223；2中國科學院大學，北京 100049

絞股藍(Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino)，屬于葫蘆科(Cucurbitaceae )絞股藍屬(Gynostemma)，是一種多年生草質攀援植物，廣泛分布于中國陜西南部和長江以南各省，在朝鮮、日本以及一些東南亞國家也有分布[1]。在中國，絞股藍已經具有幾百年的食用歷史，作為蔬菜始記載于明朝(公元1368～1644年)出版的《救荒本草》一書中[2]。此外，長期以來絞股藍還作為一種草藥被用于中國民間醫藥中，具有清熱解毒、止咳祛痰的功效。現代大量研究表明，絞股藍具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、免疫調節和抗動脈粥樣硬化[3]等多種藥理活性。絞股藍作為一種藥食同源植物，也常被制作為絞股藍茶沖泡飲用。不同的揮發性成分以一定的比例和含量組成混合物,進而呈現出不同的茶風味。香氣是茶的靈魂,關乎茶品質的優劣[4]。關于絞股藍茶揮發性成分的研究已有相關文獻報道，但使用溶劑輔助風味蒸發(SAFE)方法對其揮發性成分進行提取卻未見報道。目前，SAFE在茶揮發性成分萃取中受到越來越多的重視，低真空度及低冷凝溫度控制能夠獲得自然、真實的茶湯香氣，且蒸餾過程中可除去不揮發性物質[4]。

為了了解不同地區產絞股藍茶在揮發性成分方面是否存在差異，本研究采用SAFE對5個不同產地絞股藍茶的揮發性成分進行提取，利用氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)對其揮發性成分進行分析，通過NIST.17質譜庫檢索并運用峰面積歸一法確定各個組分的相對含量，結合文獻報道對絞股藍茶揮發性成分的香氣特征進行了詳細梳理和總結，從而為進一步研究絞股藍茶風味及資源的開發利用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

湖南張家界、安徽毫州、廣西金秀三個樣品均為市售絞股藍茶，分別購自湖南張家界愛尚園茶業有限公司、安徽亳州市茗芳百花茶葉商貿有限公司和廣西金秀圣塘山天然保健品有限公司；陜西平利樣品購于四川荷花池中藥材市場，產地陜西平利；云南玉溪樣品采自云南玉溪，樣品經中國科學院昆明植物研究所陳文允副研究員鑒定，收割后切成3～5 cm小段洗凈晾干。

表1 樣品來源及名稱Table 1 Sample source and name

1.2 試劑與儀器

二氯甲烷(色譜純,美國Meridian Medical Technologies)；C7～C30的正構烷烴(色譜純，美國SUPELCO公司)；溶劑輔助風味蒸發裝置(英國Edwards公司真空泵)；7890A-5795C型氣相色譜-質譜聯用儀(美國安捷倫公司)；HP-5色譜柱(50.0 m×0.32 mm×0.5 μm，美國安捷倫公司)；DB-wax色譜柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm，美國安捷倫公司)。

1.3 提取方法

準確稱取絞股藍茶25 g，加入沸騰的蒸餾水500 mL密閉浸泡5 min后過濾，再用冰水迅速冷卻濾液。隨后向濾液中加入150 mL二氯甲烷，超聲30 min，再以5 000 rpm的轉速離心15 min，將上清液部分倒入分液漏斗進行分液，收集二氯甲烷相，以上步驟重復3次。合并二氯甲烷相，在35 ℃恒溫水浴條件下用旋轉蒸發儀濃縮至200 mL左右，加入過量無水硫酸鈉，過濾得到萃取液。將該萃取液置于溶劑輔助風味蒸發裝置(SAFE)的滴液漏斗中，并在冷阱中加入液氮，將循環水和水浴的水溫分別設為40 ℃和45 ℃，當系統真空度達到1×10-4MPa時，緩慢打開滴液漏斗活塞，萃取過程中保持樣品勻速滴下，以制取揮發性物質萃取液。隨后在35 ℃恒溫水浴條件下使用旋轉蒸發儀將揮發性物質萃取液濃縮至1 mL，于-4 ℃保存，各個樣品均無重復。

1.4 GC-MS分析條件

質譜條件：離子源：EI源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量：70 eV，質核比掃描范圍：40～500m/z。

HP-5色譜柱，程序升溫條件為初始溫度50 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升至190 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min，分析檢測時間共67.667 min；進樣量1 μL，不分流，載氣為高純He(99.99%)；載氣流量1.2 mL/min；溶劑延遲10 min。

DB-wax色譜柱，程序升溫條件為初始溫度50 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至100 ℃，保持0 min，以2 ℃/min升至220 ℃，保持0 min，再以5 ℃/min升至250 ℃，保持5 min，分析檢測時間共86 min;進樣量1 μL，不分流，載氣為高純He(99.99%)；載氣流量1 mL/min；溶劑延遲5 min。

1.5 揮發性成分鑒定

采用質譜比對(MS)和保留指數比對(RI)相結合的方法對所分離的揮發性化合物進行鑒定。將GC-MS分析所得到的質譜譜圖與NIST14質譜譜庫進行比對；通過C7～C30正構烷烴GC-MS數據計算樣品總離子流圖中所積分的色譜峰的保留指數，與NIST Chemistry WebBook(http：//webbook.nist.gov/chemistry/)在線數據庫進行比對。

2 結果與分析

2.1 五個不同產地絞股藍揮發性成分分析鑒定

采用SAFE提取結合GC-MS分析對絞股藍茶中的揮發性化合物進行了鑒定，得到五個不同產地絞股藍茶樣品的揮發性成分總離子流圖(檢測用非極性色譜柱HP-5和極性色譜柱DB-wax)見圖1和圖2，為了鑒定結果的可靠性，只保留了兩種柱子同時檢測到的且與數據庫匹配度高的化合物。

圖1 五個不同產地絞股藍茶的揮發性成分總離子流圖(非極性色譜柱HP-5)Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile components of five different origins of G.pentaphyllum tea (non-polar chromatography column HP-5)

圖2 五個不同產地絞股藍茶的揮發性成分總離子流圖(極性色譜柱DB-wax)Fig.2 Total ion current chromatogram of volatile components of five different origins of G.pentaphyllum tea (polar chromatography column DB-wax)

五個絞股藍茶樣品總共鑒定到98個化合物，如表2所示，這些化合物分別屬于9個化學類別，包括醛類、酸類、酚類、酯類、腈類、雜環化合物、酮類、醇類和烴類及其衍生物。

表2 五個不同產地絞股藍茶揮發性成分的保留指數和相對百分含量 Table 2 Retention index and relative percentage of volatile components in G.pentaphyllum tea from five different regions

續表2 (Continued Tab.2)

續表2 (Continued Tab.2)

續表2 (Continued Tab.2)

續表2 (Continued Tab.2)

從圖3可以看出，各個樣品化合物類別大致相同，而各類別化合物數量存在一定差異。安徽樣品包含6個化學類別，其中烴類及其衍生物揮發性化合物種類最多，為16種。除安徽樣品外，其余樣品含酯類成分最多。湖南樣品為所含揮發性類型最豐富，包含了以上9個化學類別，其中苯乙腈在其它四個樣品都未檢測到。

圖3 五個不同產地絞股藍茶的揮發性成分類別及各類別數量Fig.3 The five different origins of G.pentaphyllum tea volatile component categories and the number of each category

從廣西、安徽、湖南、陜西和云南樣品中分別鑒定得到48、49、50、51和50個化合物。五個不同產地絞股藍有15個共有成分(表2)，分別為苯甲醛、正辛醛、(E，E)-2，4-庚二烯醛、苯甲醇、苯乙醛、羅勒烯、香蘭素、二氫獼猴桃內酯、月桂酸乙酯、2，4-二羥基-2，6，6-三甲基環己基乙酸γ-內酯、植酮、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、棕櫚酸乙酯、十八酸乙酯。這些共有成分包括5個醛類、7個酯類、1個烴類、1個醇類、1個酮類。

采用峰面積歸一化法計算各揮發性成分的相對百分含量，結果見表2。在五個樣品中酯類相對百分含量占比均最大，但在安徽、廣西樣品中，酯類相對百分含量第一，其次為烴類及其衍生物，而在湖南、陜西和云南樣品中，酯類相對百分含量最高，醛類第二。從表2可知五個樣品兩種色譜柱檢測結果基本一致，五個樣品二氫獼猴桃內酯、棕櫚酸乙酯含量均很高。在廣西樣品中，含量最高的化合物為二氫獼猴桃內酯，HP-5和DB-wax兩種色譜柱相對百分含量分別為6.421%和15.124%；湖南樣品二氫獼猴桃內酯含量最高，HP-5和DB-wax兩種色譜柱相對百分含量分別為7.769%和7.467%；陜西樣品二氫獼猴桃內酯含量也最高，HP-5和DB-wax兩種色譜柱相對百分含量分別為7.624%和8.416%；而在安徽樣品棕櫚酸乙酯含量最高，HP-5和DB-wax兩種色譜柱相對百分含量分別為12.471%和12.961%，云南樣品棕櫚酸乙酯含量最高，HP-5和DB-wax兩種色譜柱相對百分含量分別為7.096%和11.601%。除以上兩種主要揮發性成分外，廣西樣品主要成分還包括2，4-二羥基-2，6，6-三甲基環己基乙酸γ-內酯；安徽主要成分還包括四氯乙烷、5-羥甲基糠醛、咖啡因、反油酸乙酯、2，4-二羥基-2，6，6-三甲基環己基乙酸γ-內酯；湖南樣品主要成分還包括四氯乙烷、(E，E)-2，4-庚二烯醛、香蘭素、苯乙醇、月桂酸乙酯和2，3-二氫苯并呋喃、2，4-二羥基-2，6，6-三甲基環己基乙酸γ-內酯；陜西樣品主要成分還包括月桂酸乙酯、香蘭素、2，3-二氫苯并呋喃；云南樣品還包括苯甲醇、香蘭素、月桂酸乙酯和苯乙醇。

2.2 絞股藍揮發性成分氣味描述和氣味閾值

表3為五個絞股藍茶揮發性化合物的氣味描述和香氣閾值。通過查閱文獻，共得到51個揮發物的氣味描述，其中AH樣品28個化合物，GX樣品35個化合物，HN樣品40個化合物，SX樣品35個化合物，YN樣品31個化合物。由此可見，HN樣品氣味組成更加豐富。在五個絞股藍樣品中，酯類化合物含量最高且種類豐富，其中二氫獼猴桃內酯和棕櫚酸乙酯含量均很高。二氫獼猴桃內酯具有木香和麝香氣味[11]，其香氣閾值未見報道；而棕櫚酸乙酯具有清香氣息[14]，其在水中的香氣閾值為2 mg/L。結合香氣成分在水中的閾值和化合物相對含量，初步分析廣西絞股藍茶的主要香氣成分為1-戊烯-3-醇、苯乙醛、4-[2，2，6-三甲基-7-氧雜二環[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮、二氫獼猴桃內酯；安徽絞股藍茶的主要香氣成分為(E，E)-2，4-庚二烯醛、(+)-檸檬烯、苯乙醛、苯乙醇、二氫獼猴桃內酯；湖南絞股藍茶的主要香氣成分為(E，E)-2，4-庚二烯醛、香蘭素、二氫獼猴桃內酯；陜西絞股藍茶的主要香氣成分為香蘭素、2，3-二氫苯并呋喃、二氫獼猴桃內酯；云南絞股藍茶的主要香氣成分可能為香蘭素、苯乙醇、二氫獼猴桃內酯。五個不同產地絞股藍茶存在相同的主要香氣成分，也有各自獨特的成分，導致不同產地絞股藍茶的氣味存在差異。根據文獻報導的化合物氣味描述，絞股藍茶樣品中揮發物的特征包括“水果”、“花”、“青葉”、“木香”和“脂肪”的氣味，使絞股藍茶呈現出清香氣味。

表3 五個不同產地絞股藍茶揮發性成分的氣味描述和香氣閾值Table 3 Odor description and odor threshold of volatile components of G.pentaphyllum tea from five different origins

續表3 (Continued Tab.3)

續表3 (Continued Tab.3)

3 討論

本研究采用SAFE提取了五個不同產地絞股藍茶的揮發性成分，通過GC-MS分析及香氣結果表明五個樣品最主要成分都為二氫獼猴桃內酯和棕櫚酸乙酯，但是含量有所不同，表明不同產地絞股藍茶揮發性成分存在一定差異。Blythe等[31]使用HS-SPME/GC-MS對美國密西西比州栽種的絞股藍茶揮發性成分進行了分析，共檢出29種揮發性成分，主要成分為安息香醛(15.3%)、桉葉油醇(8.7%)、甲基庚烯酮(7.8%)、(Z)-3-己烯醛(7.6%)和α-紫羅蘭酮(6.3%)。而在本實驗中，五個絞股藍茶樣品均檢測到安息香醛，但含量遠低于該文獻報道。廣西和湖南樣品中檢測到α-紫羅蘭酮，廣西、湖南和陜西樣品中均檢測到甲基庚烯酮，桉葉油醇和(Z)-3-己烯醛在五個樣品都未檢測到。與已報道文獻相比較，絞股藍茶揮發性成分存在差異性，可能存在以下幾個因素：一是提取方法不同；二是由于揮發性成分對遺傳和環境因素，包括氣候，土壤狀況，該植物品種和生長地點都很敏感，以上條件不同導致五個不同產地絞股藍揮發性成分存在差異。

在鑒定出的大量揮發物中，能影響食物整體香氣的揮發物很少，香氣成分的種類及含量決定著絞股藍茶的質量。在五個絞股藍茶樣品中，酯類化合物含量最高且種類豐富，推測酯類對絞股藍茶香氣有一定貢獻。據文獻報道，苯甲醛、(E，E)-2，4-庚二烯醛、苯乙醛、二氫獼猴桃內酯是茶的關鍵香氣化合物[32]，而在絞股藍茶五個樣品中，以上四種化合物均可檢測到。二氫獼猴桃內酯是茶葉高質量風味的關鍵香料之一，因其在五個不同地區絞股藍中含量很高，所以推測其對絞股藍香氣可能具有重要貢獻，為絞股藍茶的關鍵香氣成分之一，該化合物在食品工業和卷煙工業中有著重要的應用價值。結合五個不同產地絞股藍茶中化合物的相對含量和閾值，可知五個不同產地絞股藍茶都具有與真正茶相同的關鍵香氣成分，還具有它本身特有的香氣特征成分。

4 結論

本實驗對云南玉溪、安徽毫州、湖南張家界、廣西金秀和陜西平利五個不同產地絞股藍茶的揮發性成分進行了鑒定，結果表明不同來源的絞股藍茶風味不盡相同。二氫獼猴桃內酯為五種不同產地絞股藍茶中共有關鍵成分，為絞股藍茶貢獻了木香氣味。此外，不同產地絞股藍茶還具有其獨特的特征成分。1-戊烯-3-醇、苯乙醛、4-[2，2，6-三甲基-7-氧雜二環[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮為廣西絞股藍茶貢獻了青葉香、花香、和木香；(E，E)-2，4-庚二烯醛，(+)-檸檬烯，苯乙醛，苯乙醇為安徽絞股藍茶貢獻了脂肪油膩氣息、柑橘味、花香；(E，E)-2，4-庚二烯醛，香蘭素為安徽絞股藍茶貢獻了脂肪油膩氣息、香草味；香蘭素、2，3-二氫苯并呋喃為陜西絞股藍茶貢獻了香草味和花香；香蘭素、苯乙醇為云南絞股藍茶貢獻了香草味和花香。絞股藍茶作為茶飲風味俱佳，且有多種保健功效，預示絞股藍具有很好的生產應用價值和市場開發前景。因此，本研究為絞股藍茶風味物質的深入研究奠定了基礎，也為絞股藍茶的開發利用提供了理論依據。