銀杏外種皮與垂序商陸葉提取物及二者復配劑對小菜蛾殺蟲活性研究

于凌一丹，向陽春，蹇寧彬，何 欽，湯 瑤，廖 陽，閆榮玲

1湖南科技學院化學與生物工程學院；2湘南優勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室；3湖南省銀杏工程技術中心，永州 425199

化學農藥在農業生產中發揮了重要作用，但也逐漸突顯出污染環境、危害健康、產生耐藥性等諸多弊端，不能很好地適應農業可持續發展的需要。而生物農藥對生態鏈破壞小，不易產生抗藥性和隨食物鏈富集，甚至兼具促植物生長等功效而成為人們關注的熱點[1,2]。

植物的根、莖、葉、花、果實、種子等不同器官次生代謝產生的可有效驅殺農業有害生物的活性物質，是植物源生物農藥開發的重要原料[3]。人們已得到核桃楸、水菖蒲、苦皮藤等多種植物的提取物，并進行了殺蟲活性測試，發現部分植物提取物表現出較好的殺蟲活性和生物農藥開發潛力[4-8]。但大部分植物品種由于難以大面積種植，或種植成本高，或提取物對農業害蟲的驅殺效果不佳等原因而限制了它們的開發利用[9,10]。因此，篩選來源豐富、成本低廉、提取簡單、活性顯著的植物提取物用于生物農藥開發意義顯著。

銀杏(GinkgobilobaL.)和垂序商陸(PhytolaccaamericanaL.)是在我國廣泛分布的兩種植物資源。前者為銀杏科銀杏屬多年生落葉喬木，人們主要利用其葉片提取物生產治療心血管疾病的藥物，而覆蓋于銀杏種子硬殼外的肉質外種皮往往作為廢棄物被舍棄；后者為商陸科商陸屬多年生草本植物，人們主要利用的是其根部，可曬干后切片作中藥使用，而生物量巨大、前處理簡單、獲取更容易的垂序商陸葉片往往也像銀杏外種皮一樣被舍棄；因此，銀杏外種皮與垂序商陸葉未得到有效利用。實質上，在我國銀杏主產區，長期農業生產經驗告訴人們可把銀杏外種皮用作土農藥來防治農業病蟲害；除此之外，已有研究也發現銀杏外種皮的乙醇或石油醚等不同溶劑提取物可對一些農業害蟲以及釘螺等有滅殺活性[11-13]。而長期以來未被人們重視的垂序商陸，其根、葉等部位的提取物也已初步被證實對朱砂葉螨、煙草花葉病毒等農業病蟲害具有一定的滅殺活性，但顯而易見，葉片獲取更容易，前處理更簡單[14-16]。因此，利用來源豐富、成本低廉的垂序商陸葉片及銀杏外種皮進行生物農藥研發潛力大、可行性強，但目前還鮮有針對二者提取物殺蟲活性的比較研究；另一方面，植物提取物單方制劑往往滅殺活性低、殺蟲譜窄等不足，復配是解決上述弊端的重要途徑?；诖?，本研究擬對不同濃度的銀杏外種皮及垂序商陸葉提取物進行小菜蛾滅殺活性測試，并進行提取物的復配，摸索確定二者的最佳配比與復配濃度和互作類型，以期進一步提高提取物的滅殺活性與滅殺譜，為后續生物農藥的開發提供理論基礎與實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

銀杏外種皮與野生垂序商陸(9月葉，去柄)經清洗、瀝干后60 ℃烘至恒重備用，處理前兩種植物材料經化學與生物工程學院黃國文博士鑒定確認為銀杏科銀杏屬的銀杏外種皮和商陸科商陸屬的垂序商陸葉片。小菜蛾卵購于河南濟源白云實業有限公司，孵化后挑選3齡幼蟲進行實驗。

1.2 儀器與試劑

JP-300B高速多功能粉碎機(永康市久品工貿有限公司)；BSA124S電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；HH-W600恒溫水浴鍋(江蘇國勝實驗儀器廠)；XH-MC-1微波合成儀(祥鵠科技有限公司)；SHZ-D循環水真空泵(鞏義市予華儀器責任有限公司)；RF52-A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；DGG-9053AD電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器廠)及容量瓶(100 mL)、塑料培養皿、燒杯、燒瓶、布氏漏斗、濾紙等；95%乙醇、無水乙醇(分析純)。

1.3 方法

1.3.1 浸提

將烘至恒重的銀杏外種皮與垂序商陸葉置粉碎機打成粉末后80目過篩。分別稱取200 g銀杏外種皮與垂序商陸葉粉末，加入95%乙醇1 500 mL，400 W微波持續處理60 s，抽濾、減壓濃縮至稠膏狀后40 ℃烘至恒重。

1.3.2 提取液單方制備

分別稱取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 g銀杏外種皮與垂序商陸葉二者的提取物，加入95%乙醇溶解并定容至100 mL，得到濃度分別為1、2、4、6、8 mg/mL銀杏外種皮與垂序商陸葉提取液，并將不同濃度提取液倒于燒杯中，標記備用。

1.3.3 滅殺活性測試

選用去掉若干外層葉片后的新鮮卷心菜葉片，制作成直徑為1 cm的圓片，置各濃度提取液中浸泡10 s后取出揮干，放入墊有濕潤濾紙的培養皿中(每皿5片)；挑選形態大小基本一致且饑餓處理2 h后的3齡小菜蛾幼蟲進行實驗，每皿10頭，每12 h清理一次培養皿并更換新鮮葉片，葉片均作提取物試液浸泡處理，以隨行試劑作為空白對照，各處理均設置5個重復，每間隔12 h即12、24、48、72、84 h(以此類推)時進行一次死亡蟲數統計，直至死亡蟲數不再增加，并根據公式“校正死亡率=〔(對照組生存率-處理組生存率)/對照組生存率〕×100%”計算校正死亡率，其中生存率根據公式：生存率=〔1-(處理后小菜蛾死亡數/供試小菜蛾數)〕×100%計算[17]。

1.3.4 提取液復配及最佳復配比測試

1.3.5 兩種提取物互作類型分析

以“1.3.4”所確定的最佳配比條件下復配液濃度為母液，稀釋得到此配比下的系列濃度梯度(稀釋后濃度分別為原母液濃度的2/3、1/2、1/3、1/4)，并按照“1.3.3”的方法對各濃度復配液進行殺蟲活性測試，再通過SPSS軟件分析得到復配劑的毒力回歸方程、半致死濃度LC50，并計算得到毒力指數及共毒系數以確定兩種提取物的互作類型(拮抗、相加、增效)。其中毒力指數=100×標準殺蟲劑LC50/供測藥劑LC50，復配劑實測毒力指數=100×標準殺蟲劑LC50/復配劑LC50，復配劑理論毒力指數=成分A毒力指數×A%+成分B毒力指數×B%，共毒系數=100×復配劑實測毒力指數/復配劑理論毒力指數。計算時以垂序商陸葉提取物為標準殺蟲劑，若計算得到共毒系數>120表示增效作用，80<共毒系數≤120之間表示相加作用，共毒系數<80表示拮抗作用[18,19]。

1.4 數據處理

數據經Excel2007、SPSS19.0以及Sigmaplot10.0等軟件整理、分析與作圖。

2 實驗結果

2.1 兩種提取物單方對小菜蛾的滅殺活性隨處理時間的變化規律

如圖1所示，銀杏外種皮與垂序商陸葉提取物均能對小菜蛾表現出較好滅殺活性。各濃度處理下，兩種提取物的小菜蛾死亡率均隨處理時間的延長逐漸增加。8 mg/mL濃度處理72 h后，小菜蛾校正死亡率分別達到74.7%(銀杏外種皮)與64.8%(垂序商陸葉)，但72 h后，各濃度下的小菜蛾死亡數不再增加，校正死亡率保持不變；除二者處理均無小菜蛾死亡的情況之外(如1、2、4、6 mg/mL處理12 h)，試驗所設各濃度的所有時間節點下，銀杏外種皮提取物的小菜蛾滅殺活性均明顯優于垂序商陸葉提取物。圖2為三個代表性處理(分別是對照組處理72 h、6 mg/mL垂序商陸葉提取物處理48 h以及8 mg/mL銀杏外種皮處理12 h)小菜蛾滅殺效果的實拍照片。

圖1 相同濃度下兩種提取物對小菜蛾的滅殺活性隨時間的變化規律Fig.1 Insecticidal activity of these two extracts against P.xylostella changing with treating time at the same concentration

圖2 提取物對小菜蛾殺蟲活性效果照片Fig.2 Photos of insecticidal activity of extracts against P.xylostella注：左圖示對照組處理72 h；中圖示6 mg/mL垂序商陸葉提取物處理48 h；右圖示8 mg/mL銀杏外種皮處理12 h。Note:Left photo showed the control group after 72 h;Middle photo showed the group of 6 mg/mL Pal extract after 48 h treatment;Right photo showed the group of 8 mg/mL Gbs after 12 h treatment.

2.2 兩種提取物單方對小菜蛾殺蟲活性隨濃度變化規律

如圖3所示，各時間節點下，兩種提取物的小菜蛾滅殺活性均隨濃度增加呈增加趨勢，且提取物處理時長越短表現出殺蟲活性所需的提取物濃度更高。相同處理時長時，要表現出滅殺活性銀杏外種皮所需濃度較垂序商陸葉低。處理12 h時，垂序商陸葉提取物所有濃度下均無滅殺活性，而銀杏外種皮8 mg/mL濃度下表現出了滅殺活性；處理24 h時，垂序商陸葉提取物從6 mg/mL開始具有滅殺活性，而銀杏外種皮提取物從1 mg/mL即開始表現出滅殺活性。

圖3 相同處理時長下兩種提取物對小菜蛾的殺蟲活性隨濃度變化規律Fig.3 Insecticidal activity changing law with concentration of these two extracts against P.xylostella under the same treating time

2.3 兩種提取物單方處理72 h條件下的毒力

不同濃度兩種提取物單方在處理72 h后的小菜蛾死亡數經SPSS軟件處理得到了各自毒力回歸方程及半致死濃度LC50，具體如表1所示。由表可知，銀杏外種皮提取物的毒力回歸方程及LC50分別為y=1.584x-1.243和2.95 mg/mL；垂序商陸葉提取物的毒力回歸方程及LC50分別為y=1.337x-0.629和6.09 mg/mL；銀杏外種皮提取物的LC50明顯小于垂序商陸葉提取物；計算得到表中X2值表明二者毒力回歸曲線擬合度良好。

表1 單方條件下兩種提取物的毒力回歸方程及LC50Table 1 The virulence regression equation and LC50 of the two kinds of extracts

2.4 不同配比復配劑對小菜蛾的殺蟲活性及與單方的比較

兩種提取物以不同比例復配后得到的復配劑濃度及對應的小菜蛾滅殺活性如表2所示。由表可知，小菜蛾滅殺活性隨兩種提取物的配比變化表現出一定的波動規律。1∶1復配時，滅殺活性僅30.22%，之后隨銀杏外種皮提取物占比的增加，滅殺活性逐步升高，當比例為1∶11時滅殺活性達最大值86.69%；之后隨復配劑中的銀杏外種皮提取物含量進一步增加，滅殺活性開始緩慢下降?？梢?，1∶11是二者的最佳復配比例。

表2 不同配比條件下復配液對小菜蛾的殺蟲活性比較Table 2 Insecticidal activity comparison of the extract mixture with different proportion against Plutella xylostella

由表2可知，最佳配比條件下，銀杏外種皮與垂序商陸葉提取物復配液的濃度為3.21 mg/mL。比較此濃度下復配液與最大濃度(8 mg/mL)下二者單方的小菜蛾校正死亡率可知，盡管復配液的濃度更低，但滅殺活性卻顯著高于二者單方(t-test，P<0.01，圖4)。

圖4 最佳配比復配液與高濃度單方殺蟲活性比較Fig.4 Insecticidal activities comparison between extracts mixture with optimum proportion and single extract with high concentration

2.5 兩種提取物復配條件下的互作類型

最佳配比下不同濃度復配液小菜蛾滅殺活性如表3所示。由表可知，在保持二者配比不變情況下，隨著復配劑濃度的減小，小菜蛾的滅殺活性逐漸降低?；诒?數據經SPSS軟件分析得到了復配液的LC50為1.24 mg/mL，毒力回歸方程為y=0.476x-0.639，具體見表4所示。

表3 最佳配比條件下不同濃度復配劑對小菜蛾的殺蟲活性Table 3 Insecticidal activity of extracts mixture with different concentrations against Plutella xylostella under the optimum proportion

表4 復配劑的LC50、毒力指數及共毒系數Table 4 LC50,toxicity index and co-toxicity coefficient of the mixture

比較可知，復配劑的LC50較二者單方時的LC50明顯降低。通過共毒系數分析可知，復配后的毒力指數為491.13 mg/mL，明顯高于兩種單方的毒力作用之和；復配后共毒系數為152.92，其值大于120說明兩種植物提取物復配后表現出顯著的增效作用。

3 討論

我國生物農藥植物資源豐富，目前已開展研究的主要集中在楝科、豆科、菊科、衛矛科等植物種類[1,10]，而關于銀杏科和商陸科植物在生物農藥領域開發利用的研究還不多見，也不夠深入。銀杏外種皮與垂序商陸葉長期以來被人們作為廢棄物舍棄而未得到有效利用，其在農業害蟲防治領域的潛在價值還未得到足夠重視和挖掘。本研究發現，銀杏外種皮與垂序商陸葉提取物均對小菜蛾表現出良好殺蟲活性，且在一定范圍內殺蟲效果隨處理時長和提取物濃度的增加而逐漸提高，進一步證實了二者在生物農藥領域的開發潛力。

本研究發現，相同濃度的銀杏外種皮提取物與垂序商陸葉提取物相比，前者的小菜蛾校正死亡率高，且銀杏外種皮提取物在更短處理時間下即可表現出殺蟲活性均提示銀杏外種皮提取物對小菜蛾具有更好的滅殺效果；而計算得到的銀杏外種皮提取物對小菜蛾的LC50更低則進一步證明了這一點。這與人們在其他植物資源研究中所得到的不同植物提取物對某一種特定農業害蟲的滅殺活性往往存在差異的結論一致[21,22]。本研究還發現，不同濃度的兩種提取物在處理12或24 h后即可出現小菜蛾死亡，而在在處理72 h后各濃度下的小菜蛾死亡數不再增加，一方面說明提取物的藥效快，兩種植物提取物進入小菜蛾體內后被迅速吸收，并觸發了蟲體內系列生理生化反應以及相關基因的異常表達；另一方面，也說明兩種植物提取物的藥效集中在一定時間區間，從而使滅殺活性表現出一定時相特征[23]。

兩種或兩種以上具有特定生物學活性的物質按一定比例混合形成可表現出新特性或更高效混合物的策略稱為復配。研究表明，化學農藥施用時，合理復配可顯著減少農藥用量、提高防治效果、減緩抗性形成[24]；人們通過對狼毒、牛心樸子、當歸、蓖麻等多種植物提取物開展了復配及活性測試也發現，復配同樣可以有效增強植物源生物農藥的毒力從而提高農藥害蟲的滅殺效果[25,26]。可見，復配是農藥施用中的一種常見易行的提效策略。對比本研究中銀杏外種皮與垂序商陸葉二者提取物的復配劑與各自單劑的小菜蛾殺蟲活性可知，復配劑在更低濃度條件下即可獲得相對單方更高的校正死亡率，且毒力指數遠高于兩種單劑毒力指數之和，共毒系數值則顯著大于120。這一系列的研究結果均表明，兩種提取物的復配表現出顯著的增效作用。而復配劑的LC50降到明顯低于兩種單劑各自LC50的1.34 mg/mL，則意味著復配除增效作用明顯外，還可有效減少農藥的施用量，達到節約成本和保護環境雙重目標。需要指出的是，復配除了提高滅殺效果的有效途徑外，還往往可以擴展生物農藥的滅殺譜，從而提高產品的應用范圍和商業價值，含有不同活性成分的垂序商陸與銀杏外種皮提取物復配后，也可能擴展了二者單方制劑時的滅殺譜，由于本研究主要關注活性這一指標，僅選用小菜蛾這一種農業害蟲作為測試對象，因此不能驗證這一推測，我們將在后續研究中對此進行進一步證明。另一方面，植物提取物滅殺農業害蟲的作用機制復雜多樣，后續研究我們將系統分析垂序商陸與銀杏外種皮提取物復配劑如何影響小菜蛾的消化、呼吸、神經、基因表達等來闡明其作用機制。

綜上所述，本研究證實了銀杏外種皮和垂序商陸葉二者提取物均具有小菜蛾殺蟲活性，且銀杏外種皮提取物的活性更佳的基礎上摸索了二者的最佳復配方案的，確定了復配劑的互作類型、最佳配比與濃度、LC50，研究結果為利用銀杏外種皮和垂序商陸葉提取物進行新型植物源生物農藥的協同開發提供了實驗依據。