重樓皂苷G通過CIP2A/PP2A信號通路抑制淋巴瘤細胞生長并促進凋亡及自噬的機制研究

劉雪文，向雨晨，劉洋洋，司 淵,4，劉 瑩,3,4*，郭 陽,3,4*

1湖北醫藥學院 基礎醫學院；2湖北醫藥學院 武當特色中藥研究湖北省重點實驗室；3湖北醫藥學院 胚胎干細胞湖北省重點實驗室；4湖北醫藥學院 生物醫藥研究院，十堰 442000

惡性淋巴瘤是一種具有較高異質性的腫瘤，發生在淋巴結中。由于淋巴系統遍布全身，淋巴瘤是一種全身性疾病，可影響體內幾乎所有組織和器官[1]。2018年，全球約有589 530例新淋巴瘤病例和274 891例與淋巴瘤相關的死亡[2]。幾乎90%的淋巴瘤病例是B細胞起源的，但是淋巴瘤也可以來源于T細胞或自然殺傷細胞[3]。目前，化學療法，放射療法，外周血干細胞移植，利妥昔單抗和靶向療法均被用于治療淋巴瘤。然而，仍有一些更具侵略性的淋巴瘤類型具有較低的存活率[4]。因此，發現新的有效治療方法對于提高淋巴瘤患者的生存期是必要的。

蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的癌性抑制因子(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A)是一種癌基因，可抑制PP2A的磷酸酶活性，進而阻遏PP2A對下游分子(包括Akt、ERK等)的去磷酸化，從而維持Akt、ERK等信號的組成性活化，而促進各種惡性腫瘤的腫瘤發生、化療耐藥、凋亡及自噬抗性、及預后不良[5-7]。我們先前曾報道，在急性髓細胞性白血病和多發性骨髓瘤中，CIP2A的異常高表達促進預后不良[8,9]。2013年，Lilja等[10]報道了CIP2A在B細胞淋巴瘤中的表達上調。CIP2A在淋巴瘤中的分子生物學功能和潛在機制尚不完全清楚。因此，迫切需要進行深入研究以探索CIP2A作為淋巴瘤治療靶點的可能性。

從中草藥中提取的天然產物仍然是腫瘤藥物發現的重要資源。延齡草(TrilliumtschonoskiiMaxim)屬于百合科，是中國的傳統中草藥[11]。廣泛分布在中國的西南、西北、華中等地，是武當及神農架地區四大神藥之一，具有鎮痛、止血、解毒等傳統功效[12]。延齡草的主要活性成分之一，polyphyllin G(PPG，圖1)是一種甾體皂苷。本文旨在探討PPG在人淋巴瘤細胞中的作用及其機制。

圖1 重樓皂苷G結構圖Fig.1 The structure of polyphyllin G

1 材料

1.1 細胞

Raji細胞株購自ATCC公司。細胞在含有10%胎牛血清(Hyclone)和抗生素的RPMI1640培養基(Hyclone)中培養，并在37 °C，5% CO2的孵箱中孵育。

1.2 藥物及試劑

經HPLC測定純度高達95%的PPG(上海詩丹德標準技術服務有限公司)。PPG溶于二甲基亞砜至30 mmol/L并在-20 °C冰箱中存儲。細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司，產品編號：C1062M)。岡田酸(Sigma-Aldrich，產品編號：O9381)；caspase-3抗體(貨號#9662)、PARP抗體(貨號#9542)、LC3抗體(貨號#12741)均購自Cell Signaling Technology；phospho-Akt抗體(Ser473，貨號sc-7985)、Akt抗體(貨號sc-8312)均購自Santa Cruz Biotechnology；GAPDH抗體(Abmart，貨號M20006)；HRP-兔二抗及鼠二抗(EarthOx公司，貨號 E030120-01、E030110-01)；Dylight 488-兔二抗(Abbkine，貨號#A23410)。PP2A免疫沉淀磷酸酶檢測試劑盒(Upstate)。

2 方法

2.1 CCK-8實驗

細胞(1×104)被接種到96孔板，預培養4 h，然后用PPG(濃度分別為2、3、4、6、8、10 μmol/L)共孵育處理24 h或48 h。采用CCK-8試劑盒(日本同仁)檢測細胞毒性，酶標儀檢測在450 nm處的吸光度。抑制率=1-(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

2.2 臺盼藍細胞計數實驗

把細胞密度約2.0×105cells/mL的細胞懸液加入12孔板，每孔加入1.980 mL，孵育24 h，每孔加入20 μL已配好100倍工作濃度的藥物，分別培養12、24、48 h后臺盼藍染色，每組細胞平行計數8次，取平均數繪制生長曲線。

2.3 DAPI染色檢測細胞凋亡

通過使用細胞離心涂片機將細胞接種在載玻片上，并用4%多聚甲醛固定。在含0.2%的Triton X-100的PBS中透化后，在含3% BSA的PBS中室溫封閉，用PBS漂洗3×5 min，DAPI染色(購自碧云天，貨號C1005)后用蓋玻片封片。356 nm紫外光為激發光，在熒光顯微鏡下觀察DAPI染色后細胞的凋亡形態并拍照。

2.4 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡實驗

細胞(1.5×105)被接種于6孔板，預培養4 h，然后用PPI共孵育處理24 h。收集上清液及用不含EDTA的胰酶消化細胞并收集，1 000 rpm，離心1 min，棄上清，用PBS輕輕重懸細胞洗滌兩次并計數。加入100 μL已稀釋好的1× Annexin V-FITC結合液，輕輕重懸。加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。再加入10 μL的PI染色液，輕輕混勻，置于冰浴中避光孵育15 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.5 蛋白免疫印跡實驗(Western blot)

收集處理后的細胞，RIPA裂解液冰浴裂解20 min后，12 000 rpm，4 °C離心10 min，取上清蛋白裂解液BCA法測定蛋白濃度，加入對應體積的SDS震蕩均勻，99 °C煮5 min使蛋白變性。SDS-PAGE電泳后，用PVDF膜進行轉膜，經5%脫脂牛奶封閉，一抗4 °C孵育過夜后，用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1.5 h，膠片顯影。

2.6 免疫熒光

通過使用細胞離心涂片機將細胞接種在載玻片上，并用4%多聚甲醛固定。在含0.2%的Triton X-100的PBS中透化后，在含3% BSA的PBS中室溫封閉，用PBS漂洗3×5 min，加入LC3一抗，4 °C過夜。再用PBS漂洗3×5 min，Dylight 488-兔二抗室溫避光孵育1.5 h。激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞自噬體形成并拍照。

2.7 PP2A活性測定

按照PP2A免疫沉淀磷酸酶檢測試劑盒說明書來測定磷酸鹽的釋放量作為磷酸酶活性的指標。100 μg的細胞分離蛋白與4 μg的抗PP2A單克隆抗體共同孵育過夜，將40 μL蛋白質A瓊脂糖珠加入上述混合物中，4 °C孵育2 h。收集珠子，分別用700 μL預冷TBS洗滌3次，500 μL絲氨酸/蘇氨酸檢測緩沖液洗滌1次。在檢測緩沖液中用750 mmol/L的磷酸肽與珠子共孵育，30 °C不斷攪拌10 min。向混合物中加入100 μL的堿式碳酸銅磷酸鹽檢測溶液，通過酶標儀測定其在650 nm處吸光度。

2.8 統計分析

3 結果

3.1 PPG對Raji細胞的增殖具有顯著的抑制作用

通過CCK-8法檢測PPG對Raji細胞增殖的影響。結果發現PPG處理24、48 h后，細胞的生長受到不同程度的抑制，PPG對Raji細胞增殖具有顯著的抑制作用,并且呈一定的時間和濃度依賴性(圖2A)，PPG處理后Raji細胞的24 h IC50值為5.75 μmol/L。臺盼藍拒染法檢測發現，PPG在3.5 μmol/L到4.5 μmol/L劑量時能顯著抑制Raji細胞的增殖(圖1B)。總之，PPG對淋巴瘤Raji細胞的增殖具有顯著的抑制作用。

圖2 PPG對Raji細胞增殖的影響Fig.2 Inhibitory effects of PPG on Raji cells注：(A)CCK-8法檢測PPG對Raji細胞的增殖抑制作用；(B)臺盼藍拒染法檢測PPG對Raji細胞的細胞活性作用。與空白對照組比較，*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001。Note:(A) The inhibitory effects of PPG on Raji cells analyzed by CCK-8 assay;(B) Inhibitory effects of PPG on cell viability of Raji cells assayed by trypan blue exclusion assay.Compared with control group,*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001.

3.2 PPG誘導Raji細胞發生凋亡及自噬

AnnexinV/FITC-PI雙標法流式細胞術檢測結果顯示，不同濃度PPG作用Raji細胞24 h后，隨著PPG濃度的增加，Raji細胞凋亡率逐漸增加(圖3A-B)。同時，DAPI染色檢測發現PPG處理后Raji細胞核發生皺縮，(圖3C)表明發生了凋亡。進一步，我們通過Western blot檢測凋亡相關蛋白表達(圖3D)，結果發現隨著PPG藥物劑量的增加，caspase-8、caspase-3及PARP切割顯著增加，表明PPI能夠通過活化caspase而誘導Raji細胞發生凋亡。為了檢測自噬是否也參與了PPG誘導的細胞死亡，我們檢測了PPG后Raji細胞中自噬相關因子LC3、Beclin 1的表達水平。結果發現在PPG處理組細胞中LC3-II和Beclin1表達顯著上調，這表明PPG促進Raji細胞自噬的發生(圖3E)。當自噬啟動時，LC3蛋白C末端被切割并且產生 LC3-II蛋白，然后在自噬體中轉移。為了進一步檢測自噬體是否形成，我們通過免疫熒光檢測內源LC3，結果發現對照組細胞呈彌漫性熒光染色，PPG處理的Raji細胞呈現出斑點狀熒光染色(圖3F)，說明LC3在自噬體中發生了再分配。另外，PPG處理導致p62的下調(圖3E)，這表明自噬體與溶酶體發生了融合。總之，以上結果表明，PPI能在淋巴瘤Raji細胞中誘導caspase依賴的細胞凋亡和自噬。

圖3 PPG誘導Raji發生凋亡及自噬Fig.3 PPG induces apoptosis and autophagy in Raji cells注：(A、B)不同劑量PPG處理Raji細胞24 h，通過AV/PI染色和流式細胞術檢測細胞凋亡；(C)用不同劑量的PPG處理Raji細胞并24 h，通過DAPI染色，熒光顯微鏡檢測細胞核形態變化；(D、E)不同劑量PPG處理Raji細胞24 h，通過Western blot檢測相關蛋白的表達情況；(F)不同劑量PPG處理Raji細胞24 h，免疫熒光檢測LC3自噬體形成情況。與0 μmol/L PPG組比較，*P <0.05，**P <0.01。Note:(A,B) Raji cells were treated with different doses of PPG for 24 h,and apoptosis was detected by AV/PI staining and flow cytometry;(C) Raji cells were treated with different doses of PPG for 24 h.DAPI staining and fluorescence microscopy were used to detect changes in nuclear morphology;(D,E) Raji cells were treated with different doses of PPG for 24 h,and the expression of apoptosis-related proteins was detected by western blot;(F) Raji cells were treated with different doses of PPG for 24 h,and immunofluorescence was used to detect the formation of LC3 autophagosomes.Compared with 0 μmol/L PPG group,*P <0.05, **P <0.01

3.3 PPG下調Raji細胞中CIP2A表達而重激活PP2A活性

用濃度遞增的PPG處理Raji細胞 24 h后，通過Western blot 法檢測凋亡及自噬上游相關信號通路蛋白的表達變化。結果顯示，PPG下調了CIP2A的蛋白表達(圖4A)。CIP2A是蛋白磷酸酶PP2A的內源性抑制劑，同時，腫瘤明星信號分子Akt的去磷酸化受到PP2A的廣泛調節[13]。因此，我們進一步檢測PPG對CIP2A的下調是否可以恢復PP2A活性。結果發現，PP2A活性在用PPG處理的Raji細胞中顯著上調(圖4B)。此外，PPG亦能夠下調PP2A下游Akt磷酸化(pAkt)(圖4C)，表明Akt活性下降。總之，以上這些結果表明PPI可能是通過影響下調CIP2A而重激活PP2A的磷酸酶活性。

圖4 PPG下調CIP2A而重激活PP2AFig.4 PPG down-regulates CIP2A and reactivates PP2A注：(A)PPG處理Raji細胞24 h后，Western blot檢測相關蛋白的表達；(B)PPG處理Raji細胞24 h后，PP2A磷酸酶活性試劑盒測定分析PPG處理后的Raji細胞中PP2A的活性；(C)PPG處理Raji細胞24 h后，Western blot檢測相關蛋白的表達。與0 μmol/L PPG組比較，*P <0.05。Note:(A) Raji cells were treated with PPG for 24 h,the expression of related proteins was detected by Western blot;(B) Raji cells were treated with PPG for 24 h,PP2A phosphatase activity kit was used to measure and analyze the activity of PP2A;(C) Raji cells were treated with PPG for 24 h,the expression of related proteins was detected by Western blot.Compared with 0 μmol/L PPG group,*P <0.05.

3.4 重激活PP2A活性是PPG誘導凋亡及自噬的關鍵環節

為了檢測PPG誘導的Raji細胞凋亡及自噬是否是由PP2A重激活引起，我們通過PP2A抑制劑岡田酸(okadaic acid，OA)與PPG共處理檢測細胞凋亡及自噬相關因子。數據表明OA顯著逆轉了由PPG誘導的細胞增殖抑制、細胞凋亡及自噬(圖5A和5B)。總之，這些結果表明PP2A的重激活是PPG通過抑制CIP2A來促進細胞凋亡及自噬的關鍵環節。因此，我們得出以下結論，PPG在一定程度上是通過抑制CIP2A/PP2A/Akt信號軸來抑制淋巴瘤細胞增殖并誘導凋亡及自噬。

圖5 重激活PP2A活性是PPG誘導凋亡及自噬的關鍵環節Fig.5 Reactivation of PP2A activity is a key step in PPG-induced apoptosis and autophagy注：(A)PPG(4.5 μmol/L)和/或OA(20 nmol/L)處理Raji細胞24 h后，CCK-8法檢測細胞生長；(B)PPG(4.5 μmol/L)和/或OA(20 nmol/L)處理Raji細胞24 h后，Western blot檢測相關蛋白表達。OA、PPG共處理組與PPG組相比，*P <0.05.Note:(A) After 24 h treatment of Raji cells with PPG (4.5 μmol/L) and/or OA (20 nmol/L),CCK-8 was used to detect cell growth;(B) After 24 h treatment of Raji cells with PPG (4.5 μmol/L) and/or OA (20 nmol/L),Western blot was used to detect the expression of related proteins.OA,PPG co-treated group compared with PPG group,*P <0.05.

4 討論

天然中草藥來源的小分子化合物一直是腫瘤藥物發現的重要資源。PPG是一種生物活性甾體皂苷，已被證明在某些腫瘤類型存在治療效果[14,15]，而其在淋巴瘤中的治療作用尚無報導。本研究揭示了一種新的PPG抗癌機制，即通過抑制CIP2A/PP2A/Akt信號軸抑制淋巴瘤細胞生長及誘導凋亡。

凋亡途徑的異常在血液惡性腫瘤的發生發展中起關鍵作用，誘導細胞凋亡亦是腫瘤治療的重要策略[16,17]。流式細胞術證明PPG能有效誘導Raji細胞凋亡(圖3A)。細胞凋亡伴隨著多種形態學變化，例如核皺縮及形成凋亡小體。通過DAPI染色發現，PPG處理后的Raji細胞的細胞核發生明顯的皺縮(圖3C)。Caspase-3以及PARP蛋白的水解(圖3D)，表明PPG可誘導Raji細胞發生caspase介導的凋亡。自噬是II類程序性細胞死亡。自噬過程中，LC3II對自噬體的形成至關重要，而Beclin1是促進自噬體形成的關鍵因子[18]。我們的結果表明，PPG通過上調LC3II和 Beclin1 表達水平而激活自噬(圖3E)。進一步，免疫熒光檢測發現PPG促進自噬體形成(圖3F)。另外，PPG能夠下調p62表達(圖3E)，這表明PPG可能通過促進自噬體與溶酶體融合而引起p62降解。以上表明PPG促進淋巴瘤細胞凋亡及自噬的發生。某些情況下，自噬抑制凋亡，是細胞的存活途徑；但自噬本身也會誘發細胞死亡，或與凋亡共同作用及在凋亡缺陷的情況下作為備份機制誘導細胞死亡[19]。而PPG則可能引發兩種通路的關聯調控。

CIP2A的過表達通常與多種人類腫瘤相關，而抑制CIP2A亦是腫瘤靶向治療的新策略[20]。在本研究中，我們發現PPG能夠在蛋白水平上引起Raji細胞中CIP2A的顯著下調(圖4A)。進一步調查其下游分子PP2A的活性，發現PPG通過下調CIP2A重激活了Raji細胞中的PP2A磷酸酶活性，從而促進Akt的去磷酸化(圖4B和4C)。因此，PPG可能通過下調CIP2A而重新激活PP2A，進而抑制其下游重要癌性信號分子Akt的活性。Akt是參與眾多腫瘤細胞增殖、分化、凋亡、自噬及多藥耐藥的關鍵信號節點[21]。由此，我們提出PPG可能通過CIP2A/PP2A/Akt信號軸抑制淋巴瘤細胞生長并促進凋亡、自噬。進一步PP2A抑制劑OA可以拮抗PPG對淋巴瘤細胞凋亡、自噬的活化作用(圖5)。這些結果證實了PP2A的重激活在PPG下調CIP2A抑制淋巴瘤通路中起關鍵作用。

總之，本課題的研究結果為進一步深入探討PPG對CIP2A/PP2A/Akt信號轉導通路的作用機制，以及PPG的抗淋巴瘤作用提供了研究基礎。