長蛸oct-GnRH基因的cDNA 克隆及組織表達分析

朱之發，邊 力，王亞美，陳四清，楊珍珍，李鳳輝

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東青島 266071；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；3.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；4.青島海洋科學與技術試點國家實驗室，海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東青島 266071）

在海洋資源逐年下降的情況下，開發新的海洋物種養殖尤為重要。開展新物種養殖首要任務是實現人工繁育，需了解該物種的繁殖特點，從而掌握繁殖的時間和環境條件。促性腺激素釋放激素（GnRH）是由下丘腦分泌的十肽激素，是動物生殖過程中的關鍵激素之一。1971年，BABA等［1］和AMOSS等［2］首先從下丘腦分離出GnRH。在脊椎動物中，GnRH是下丘腦-垂體-性腺生殖軸（HPG）的關鍵神經肽，是生殖功能調節的核心。哺乳動物GnRH最初是從豬和羊的大腦中分離出［1，3］，在非哺乳脊椎動物中，又分離出13種GnRH分子形式［4-6］。無脊椎動物中的GnRH最初是使用哺乳動物和雞的GnRH抗血清，通過異源免疫組化技術獲得的［7-11］。盡管在無脊椎動物中缺乏GnRH的分子特征，但在章魚（頭足綱八腕目）神經系統檢測到雞的GnRH-I免疫反應［10-11］。目前已從真蛸的中樞神經系統中分離出具有脊椎動物GnRHs結構的神經肽，克隆到編碼受體蛋白的cDNA，命名為oct-GnRH，屬于GnRH神經肽家族［12］。但對于長蛸oct-GnRH基因克隆及其特異性表達尚未見相關報道。

長蛸俗稱大蛸、長腿蛸等，屬于八腕目（Octopoda），蛸科（Octopodidae），蛸屬，分布于韓國、中國、日本和俄羅斯庫頁島沿海水域［13-14］，喜穴居，肉質鮮嫩，蛋白質豐富且營養均衡［15］，可食用部分占身體的90%以上，可加工成干制品，食用方式多樣［8］，是我國沿海重要的經濟蛸類［16］。長蛸作為重要的經濟物種，近年來我國開始對其進行人工養殖研究，但目前對于長蛸的繁育機制尚未完全了解，處于探究階段，導致長蛸的工廠化養殖與苗種繁育較為困難。GnRH是控制章魚生殖的關鍵神經肽［12］，因此開展GnRH基因和表達的研究，可為長蛸人工養殖與苗種繁育提供理論支持。本研究運用cDNA末端快速擴增和實時熒光定量PCR技術，獲得oct-GnRH基因cDNA的序列，分析GnRH基因在長蛸體內各器官的表達水平，旨在完善長蛸的分子與生殖生物學信息，為研究長蛸腦部結構功能及生殖相關神經肽的分泌特征提供數據支持，為實現長蛸工廠化繁育提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織樣品制備

取性成熟長蛸，觀察其右邊第3條腕，確定其性別，雄性長蛸和雌性長蛸各取3尾，體質量為152～189 g，解剖后分別取食道上神經團、食道下神經團、視葉區、吸盤、腕肌肉、軸神經索、視網膜、心臟、腎臟、肝胰臟、鰓、前唾液腺、后唾液腺、卵巢、纏卵腺、精巢、精頰囊、前列腺、食道、胃、胃盲囊、腸、胴部肌肉、皮膚，立即放入含有RNA保存液的2.0 mL離心管中，液氮速凍后，將樣品保存于-80℃超低溫冰箱，待用。

1.2 試劑與試劑盒

PremixTaqTM（TaKaRaTaqTMVersion 2.0）、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株感受態細胞、pMDTM18-T Vector試劑盒、RACE試劑盒（SMARTTMRACE cDNA Amplification RACE）、反轉錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）、DNA凝膠回收試劑盒（TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0）和SYBR?Premix ExTaqTM購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

本研究采用Trizol法分別提取雌雄長蛸各組織的總RNA，取2μL總RNA用于1.0%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA的完整性，取1 μL總RNA用于紫外分光光度計（NanoDrop 2 000 Thermo Scientific，USA）檢測所提取RNA的純度及濃度。利用反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA，利用RACE試劑盒分別合成5′與3′RACE cDNA模板，所有操作根據試劑盒說明書進行。

1.4 GnRH基因核心序列克隆

根據長蛸已知的GnRH保守序列和NCBI GenBank中真蛸GnRH基因（GenBank登錄號：AB037165），通過Primer 5.0設計引物GnRH F1和GnRH R1（表1），以食道下神經團組織的cDNA為模板擴增核心序列。PCR反應體系（20 μL）為：PremixTaqTM10μL、GnRH F1（10 μmol·L-1）0.5μL、GnRH R1（10μmol·L-1）0.5μL、cDNA（1μg·μL-1）1μL及ddH2O 8 μL。PCR反應條件：94℃5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃60 s，35個循環；72℃10 min。擴增產物經1.0%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測，在DUT-48超薄型紫外切膠儀中切膠，經DNA凝膠回收試劑盒回收純化，克隆到pMD18-T Vector中，轉化到DH5α感受態細胞中過夜培養。挑取陽性單克隆，經菌落PCR鑒定，篩選目的菌液送至華大基因公司測序。

1.5 GnRH基因全長克隆

根據測序所得核心序列設計特異性引物3′RACE 1、5′RACE 1、3′RACE 2與5′RACE 2，通過巢式PCR進行3′和5′端RACE擴增。3′端擴增：以3′RACE cDNA為模板，分別加入接頭引物UPM與引物3′RACE 1組合、接頭引物NUP與引物3′RACE 2組合擴增3′端基因序列；5′端擴增：分別加入接頭引物UPM與引物5′RACE 1組合、接頭引物NUP與引物5′RACE 2組合擴增5′端基因序列。

PCR反應體系（20μL）：PremixTaqTM10μL、3′或5′特異性引物0.5μL、UPM或NUP 0.5μL、RACE-cDNA 1μL及ddH2O 8μL。PCR反應條件：94℃5min；94℃30 s，60℃30 s，72℃60 s，35個循環；72℃10 min。將PCR產物進行檢測、膠回收、純化、連接與轉化培養。挑取陽性單克隆，經菌落PCR鑒定后送至華大基因公司測序。

1.6 GnRH基因序列分析

使用軟件Contig Express軟件對GnRH基因的測序結果進行拼接、驗證，利用ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi）預測GnRH基因的開放閱讀框。利用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）、SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）、Signal 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線生物學軟件分析GnRH編碼蛋白的基本物理性質、信號肽、跨膜結構及結構域。用NCBI搜索同源蛋白序列，并使用軟件DNAMAN對其進行蛋白序列的多重比較，利 用MEGA5.2［12］軟 件，采 用 鄰 接 法（neighbor-joining）構建系統進化樹。

1.7 實時熒光定量PCR

根據GnRH基因的核心序列，通過Primer5.0設計熒光定量特異性引物GnRH F/R，β-actin F/R作為內參，以長蛸不同組織的cDNA為模板，使用Mastercycler epgradient S realplex4實時熒光定量PCR儀（Eppendorf，德國），采用2-ΔΔCt的計算方法分析GnRH基因的相對表達量。20μL反應體系：SYBR?Premix ExTaqTM（2x）10μL、ROX Reference Dye II（50x）0.4μL、GnRH F（10μmol·L-1）0.4μL、GnRH F（10μmol·L-1）0.4 μL、cDNA（50ng·μL-1）2μL及ddH2O 6.8μL，反應程序：95℃5 min；95℃15 s，60℃30 s，40個循環；95℃15 s；60℃60 s；95℃15 s。

數據處理為GnRH基因相對表達量的平均值±標準差（Mean±SD），生物學重復n=3。使用SPSS22.0軟件對實時熒光定量PCR結果進行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan多重比較，P＜0.05表示差異顯著，并用Excel2010軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 oct-GnRH基因序列分析

長蛸oct-GnRH基因全長853 bp，命名為oct-GnRH，開放閱讀框（ORF）長270 bp，編碼89個氨基酸。5′-UTR和3′-UTR分別長153 bp和430 bp。經過ExPASy、SMART、Signal4.1和NCBI在線生物學軟件分析，推斷oct-GnRH的89個氨基酸分子量為9 989.51Da，理論等電點為7.77，7個負電荷殘基，8個正電殘基，1個跨膜結構處于13～32位編碼20個氨基酸，1個信號肽處于1～31位編碼31個氨基酸，2個結構域分別為7～86位編碼80個氨基酸的BEN結構域和45～77位編碼33個氨基酸的Pox-A3L結構域（圖1）。

表1 GnRH基因的克隆及表達分析所用引物Tab.1 Primers used in cloning and characterizing the GnRH gene

2.2 氨基酸序列種間比對

在NCBI中，將本研究的長蛸oct-GnRH氨基酸序列與其他物種的GnRH基因編碼的氨基酸序列進行比對，結果顯示，該氨基酸序列與真蛸（Octopus valgaris）相似度最高（96.63%），其次是曼氏無針烏賊（Sepiella japonica）（74.16%）和劍尖槍烏賊（Uroteuthis edulis）（70.79%）。其他物種相似度較低：菲律賓簾蛤（Ruditapes philippinarum）（44.83%）、法螺（Charonia tritonis）（34.25%）、網紋野蛞蝓（Deroceras reticulatum）（31.03%）、澳大利亞綠邊鮑魚（Haliotis laevigata）（45.28%）、皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）（45.28%）、蝦 夷 扇 貝（Mizuhopecten yessoensis）（40.32%）、鴨 嘴 海 豆 芽（Lingula anatina）（31.88%）、海蛞蝓（Aplysia californica）（31.36%）、耳鮑（Haliotis asinina）（35.23%）。利用DNAMAN軟件對不同物種的氨基酸序列（表2）進行比對，結果顯示（圖2），包括長蛸在內的頭足類均含有保守的BEN結構域和Pox-A3L結構域。

圖1 長蛸oct-GnRH基因cDNA序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced am ino acid sequences of oct-GnRH gene of Octopusm inor

圖2 長蛸oct-GnRH氨基酸序列的物種間比對Fig.2 M u ltip le alignments of oct-GnRH am ino acid sequences of Octopusm inor between species

2.3 系統進化樹

利用MEGA 5.2軟件對oct-GnRH基因編碼的氨基酸序列進行系統進化分析。所選物種（表2）包括真蛸、曼氏無針烏賊、劍尖槍烏賊、菲律賓簾蛤、法螺、網紋野蛞蝓、澳大利亞綠邊鮑魚、皺紋盤鮑、蝦夷扇貝、海蛞蝓、耳鮑、鴨嘴海豆芽。結果顯示（圖3），長蛸與同為蛸屬的真蛸進化上關系最近，其次是同為頭足綱烏賊目的曼氏無針烏賊與劍尖槍烏賊，隨后是軟體動物門中的腹足綱與瓣鰓綱等；腕足動物門無鉸綱無穴目海豆芽科的鴨嘴海豆芽與長蛸的進化關系最遠。

表2 物種GnRH氨基酸序列登錄號Tab.2 Sequence ID of species GnRH am ino acid sequence

2.4 長蛸GnRH基因組織特異性表達

利用β-actin和oct-GnRH正反引物在聚合酶鏈式反應（PCR）下檢測oct-GnRH基因在長蛸24個組織中是否表達。結果表明，食道上神經團、食道下神經團、視葉、腕肌肉、軸神經索、腎臟、肝胰臟、后唾液腺、卵巢、纏卵腺、精巢、精頰囊、前列腺、食道、胃、胃盲囊、腸和胴部肌肉18個組織中有oct-GnRH基因的表達，吸盤、視網膜、心臟、鰓、前唾液腺和皮膚6個組織中無GnRH基因的表達。運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測oct-GnRH基因在長蛸18個組織（有oct-GnRH基因表達）的表達水平。圖4～圖6顯示，在長蛸的雌雄個體中oct-GnRH基因在食道上神經團和食道下神經團表達量較高，其中食道下神經團表達量最高，雌性個體的表達量要顯著高于雄性個體。在剩余組織中，雄性的視葉、腕肌肉、軸神經索、肝胰臟、精巢和雌性的視葉、腕肌肉和軸神經索含量較高，剩余組織表達量較低。表明oct-GnRH主要的表達位置為神經系統，中樞神經系統表達量最高，腕部肌肉和肝胰臟的表達量較高。腕部肌肉中oct-GnRH的表達量較高原因與腕部含有大量的神經節有關［17］，肝胰臟中oct-GnRH的表達量較高可能與肝胰臟的體積大且是主要的代謝器官有關。

圖3 長蛸與其他物種基于GnRH氨基酸序列的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of GnRH am ino acid sequences from Octopusm inor and other vertebrates

圖4 oct-GnRH基因在雄性長蛸組織器官中的相對表達量Fig.4 Relative exp ression of oct-GnRH gene in tissues ofmale Octopusminor

圖5 oct-GnRH基因在雌性長蛸組織器官中的相對表達量Fig.5 Relative expression of oct-GnRH gene in tissues of female Octopusm inor

圖6 oct-GnRH基因在雌雄長蛸食道上神經團與食道下神經團中的相對表達量Fig.6 Relative expression of oct-GnRH gene in the supraesophagealmass and subesophagealmass of Octopusminor

3 討論

某些章魚（頭足綱八腕目）體內的十二肽GnRH（oct-GnRH）是促性腺激素釋放激素神經肽家族的成員［18］，脊椎動物的GnRH是十肽結構，oct-GnRH氨基酸結構中多了-Asn2-Tyr3-殘基［12］。oct-GnRH前體蛋白的結構與脊椎動物的GnRH相似，由信號肽、肽激素序列、-Gly-Lys-Arg序列和GnRH相關蛋白（GAP）序列組成［12］。近幾年對多種無脊椎動物的GnRH同源基因研究表明oct-GnRH神經肽的存在［19-20］。在軟體動物中，頭足綱3個物種［12，21-22］、瓣鰓綱2個物種［23-24］和腹足綱2個物種［19，25］中已發現oct-GnRH。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中存在具有GnRH和昆蟲脂肪代謝激素結構的肽（GnRH-AKH）［26］，推測有GnRH神經肽超家族的存在［20］。GnRH在脊椎動物的大腦中分布廣泛，參與多種生理功能（行為、代謝和免疫）的調控［27］。oct-GnRH在章魚腦內神經纖維中被大量檢測到，表明oct-GnRH對中樞神經系統的神經傳遞和神經調節起作用，包括中樞神經系統控制進食順序［28］、觸覺和視覺記憶系統［29］、其他器官系統和行為［30］。

本研究首次獲得長蛸的oct-GnRH基因，cDNA全長為853 bp，開放閱讀框為270 bp，5′非編碼區為153 bp，3′非編碼區430 bp。長蛸oct-GnRH編碼的89個氨基酸分子量為9 989.51Da，理論等電點為7.77，7個負電荷殘基，8個正電殘基，1個跨膜結構處于13～32位編碼20個氨基酸，1個信號肽處于1～31位編碼31個氨基酸，2個結構域分別為7～86位編碼80個氨基酸的BEN結構域和45～77位編碼33個氨基酸的Pox-A3L結構域。從劍尖槍烏賊的中樞神經系統（CNS）克隆的cDNA的開放閱讀框在核苷酸序列上與長蛸的oct-GnRH相似，約為80.5%［26］。曼氏無針烏賊和劍尖槍烏賊GnRH的氨基酸序列與長蛸的oct-GnRH相同。本研究中長蛸的oct-GnRH基因編碼的氨基酸序列與真蛸相似度最高（96.63%），其次是曼氏無針烏賊（74.16%）和劍尖槍烏賊（70.79%），都含有BEN結構域和Pox-A3L結構域，表明頭足類的oct-GnRH具有高度相似性。

長蛸oct-GnRH基因的實時熒光定量PCR結果表明，oct-GnRH基因的表達量在雌雄個體食道上神經團和食道下神經團中差異較小，oct-GnRH基因主要表達位置為神經系統，中樞神經系統表達量最高，其次是腕部肌肉和肝胰臟的表達量較高。而軟體動物中對GnRH相關功能研究較少，主要對脊椎動物GnRH亞型進行研究［20，31-36］。目前，已經在少數物種上進行了基于同源GnRH的生理學研究。在真蛸中，oct-GnRH刺激輸卵管收縮和性腺類固醇合成，在生殖過程中起作用［37-38］。然 而，在加利 福尼 亞 海兔（Aplysia californica）中，同源的GnRH能調節多種中樞神經元的活性并抑制袋狀細胞放電，但對生殖無影響［39-40］。將oct-GnRH注 射 到 加 州 雙 斑 蛸（Octopus bimaculoides）幼體的中樞神經系統附近的血竇中，會導致運動異常（爬行搖晃和腕部扭曲）及外套膜、心臟和色素體的過度活躍，表明oct-GnRH參與神經葉的神經傳遞與調節。在真蛸的腦亞腳葉、嗅葉、視腺和視腺神經中檢測到oct-GnRH，表明oct-GnRH參與控制視腺的活動：生殖細胞的增殖、性腺的成熟和卵黃蛋白的合成［41］。oct-GnRH在日本鵪鶉（Coturnix coturnix）的垂體前葉細胞中顯示出促黃體生成激素的活性［12］。oct-GnRH促進卵巢和精巢中雄性激素、孕酮和17β-雌二醇（E2）的基礎類固醇合成［38］，活性與GnRH在脊椎動物生殖系統中的活性相似［42］，oct-GnRH存在于含有精子的組織中［37］，表明oct-GnRH可能通過孕酮合成促進精子的預活化。oct-GnRH存在于視葉叢狀層中，表明oct-GnRH參與視覺輸入對視神經的調控［37］。本研究結果也顯示，oct-GnRH主要表達于神經系統及神經纖維所控制的部分組織，與多種生理功能相關。

oct-GnRH可能是腦腳亞葉或嗅葉-視腺-性腺軸中的關鍵肽，作用類似于脊椎動物體內在下丘腦-垂體-性腺-性腺軸的GnRH［37］。視腺中的oct-GnRH或未發現的促性腺激素可能釋放到血液中并作用于性腺，通過oct-GnRH的受體調節性類固醇來誘導性成熟和產卵［38，43］。除了促進生殖作用外，oct-GnRH是一種具有多種功能的肽，并具有許多重要的生理作用，包括進食、記憶、運動和自主功能［37］。因此，從分子層面研究長蛸的oct-GnRH的結構、表達特點及在生殖發育中的作用，可為了解長蛸生殖發育中的神經網絡與神經肽調節機制提供直接數據，最重要的是為實現長蛸的工廠化養殖與苗種繁育技術的探索提供理論支持和數據參考。