循環腫瘤細胞在前列腺癌診斷中的價值

周旭東 趙興華 許長寶 郝斌 李武學 趙永立

鄭州大學第二附屬醫院泌尿外科（鄭州450000）

前列腺癌是泌尿外科最常見的惡性腫瘤之一，在美國前列腺癌的發病率已經超過肺癌成為第一位危害男性健康的腫瘤［1］。近年來，隨著人們生活水平及生活方式的改變，前列腺癌的發病率和病死率呈逐年上升趨勢。由于前列腺癌臨床癥狀不明顯，發病隱匿，診斷率低，發生、發展以及治療復雜，嚴重危害男性健康，因此對前列腺癌患者進行進行早期篩查診斷以及干預治療顯得尤為重要［2-3］。目前的診斷方法主要包括直腸指診（DRE），前列腺特異抗原（PSA）以及穿刺活檢，但這些方法存在一定的不足，無法早期準確全面的評估患者的病情。循環腫瘤細胞（CTCs）作為一種非侵入性的新型診斷標志，有助于腫瘤微轉移的早期發現和預后評估，在治療檢測以及個體化治療中具有重要的臨床意義［4-5］。目前，有研究表明CTCs 檢測有助于前列腺癌的早期診斷，但尚無研究確定其最佳臨界值，并且缺乏與PSA 的隨機對照研究［6］。本文旨在評估CTCs 水平與前列腺癌患者臨床指標、病理評分等的相關性，探討CTCs 檢測在前列腺癌初步診斷和預后判斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2016年9月至2019年9月在鄭州大學第二附屬醫院泌尿外科住院治療的78 例前列腺癌患者作為研究組，年齡68 ～89 歲，平均年齡（73.54 ± 6.17）歲。選擇同期于我院體檢的健康人群35 例作為對照組，年齡67 ～87 歲，平均年齡（73.28 ± 6.12）歲。所有研究組患者均進行前列腺穿刺活檢，記錄Gleason評分結果，其中36例行前列腺癌根治性切除術，記錄病理分期結果；所有入選者均知曉本次研究并自愿簽署知情同意書。排除標準：（1）合并有其他腫瘤病史者；（2）合并嚴重基礎疾病者；（3）合并血栓性疾病、感染性疾病者；（4）1 周內血透、輸血以及使用凝血藥物者；（5）有長期激素服用史或者1個月內有手術創傷病史者。

1.2 方法

1.2.1 CTCs 檢測本研究應用CanPatrolTM二代CTC 檢測技術對所有研究對象外周血進行CTCs檢測，步驟如下：（1）樣本采集：使用8 號采血針采集外周血樣本7.5 mL 置于EDTA 抗凝采血管，并進行預處理；（2）CTC 富集：將預處理樣本于過濾器中進行抽濾，利用CTC 和白細胞的大小差異進行分離和富集；（3）基因探針雜交：使用DAPI 核染色和CD45、上皮型和間質型mRNA 進行雜交；（4）信號標記探針雜交：使用標記有熒光免疫的標記針與擴增探針進行雜交，產生熒光信號；（5）識別：利用自動成像熒光顯微鏡閱讀熒光信號。DAPI 陽性、CD45 陰性、間質型標志物波形蛋白和扭曲蛋白或上皮型標志物EpCAM 和細胞角蛋白8/18/19陽性則判定為CTC。根據國內外參考文獻［7］，定義CTCs ≥5個/7.5 mL外周血為CTCs陽性，＜5個/7.5 mL外周血為CTCs 陰性。

1.2.2 資料采集所有入組對象記錄年齡、體質指數（BMI）、既往病史、生活習慣（吸煙史、飲酒史）、血紅蛋白（HB）、血小板（PLT）、纖維蛋白原（FIB）、D-二聚體（D-D）、白蛋白（ALB）、堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH）、前列腺特異抗原（PSA）、前列腺磁共振（MRI）、骨掃描、腹部CT 等結果；研究組記錄前列腺穿刺活檢后Gleason 評分結果并記錄36 例行前列腺癌根治術后患者的病理分期結果。

1.3 統計學方法運用SPSS 22.0軟件對數據進行錄入和分析。計量資料以平均數±標準差表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析；計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究組和對照組一般資料及CTCs 陽性率比較兩組年齡、BMI、高血壓史、高血脂癥史、糖尿病史、吸煙史、飲酒史差異無統計學意義（P＞0.05），研究組CTCs 陽性率顯著高于對照組（P＜0.05）。研究組中41 例發生前列腺癌轉移，其中CTCs 陽性者24 例（58.54%）；37 例未發生前列腺癌轉移，其中CTCs 陽性者8 例（21.62%），前者較后者CTCs 陽性率顯著升高（χ2=10.954，P=0.001）。見表1。

表1 兩組一般資料及CTCs 陽性率比較Tab.1 Comparison of general data and CTCs positive rate between the two groups 例（%）

2.2 血清CTCs、PSA 水平對前列腺癌的診斷價值以病理結果為金標準，利用四格表預測CTCs、PSA 對前列腺癌的診斷價值，結果顯示，靈敏度分別為88.46%、85.89%，特異度分別為74.28%、65.71%，準確率分別為84.07%、79.64%，見表2、3。

表2 CTCs 和PSA 對前列腺癌的診斷結果Tab.2 CTCs and PSA diagnosis of prostate cancer 例

2.3 前列腺癌患者CTCs 陽性組和陰性組生化指標比較前列腺癌患者CTCs 陽性組HB、ALB 水平明顯低于CTCs 陰性組（P＜0.05），PLT、FIB、D-D、AKP、LDH 水平明顯高于CTCs 陰性組（P＜0.05），差異有統計學意義，見表4。

2.4 研究組CTCs與PSA和Gleason評分的相關性分析Pearson 法分析顯示，CTCs 與PSA、Gleason評分均呈正相關關系（r=0.601，P＜0.05；r=0.316，P＜0.05），見圖1。

表3 CTCs、PSA 診斷前列腺癌的效果Tab.3 The effects of CTCs and PSA in diagnosis of prostate cancer %

表4 CTCs 陽性組和陰性組生化指標比較Tab.4 Comparison of biochemical indexes between CTCs positive group and negative group ±s

表4 CTCs 陽性組和陰性組生化指標比較Tab.4 Comparison of biochemical indexes between CTCs positive group and negative group ±s

生化指標HB（g/L）PLT（×109/L）FIB（g/L）D-D（μg/L）ALB（g/L）AKP（U/L）LDH（U/L）CTCs 陽性組（n=32）109.14±5.64 210.97±12.52 4.61±0.29 349.57±26.43 34.17±1.02 118.62±14.23 192.46±12.57 CTCs 陰性組（n=46）132.71±6.06 164.73±10.79 3.24±0.26 271.32±22.85 39.49±1.08 82.38±10.27 184.73±10.13 t 值17.377 17.426 21.830 13.947 21.887 13.072 3.001 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.004

2.5 36 例前列腺癌手術患者CTCs 與病理分期的關系根據前列腺癌根治手術標本的病理分期，將36 例手術患者分為Ⅰ期6 例、Ⅱ期12 例、Ⅲ期14 例和Ⅳ期4 例，各組患者年齡差異無統計學意義（P＞0.05）；PSA 水平隨分期惡化程度加重而增加；CTCs 個數亦隨病理分期惡化程度加重而增加，見表5。

表5 36 例手術患者CTCs 與病理分期的關系Tab.5 Relationship between CTCs and pathological stage in 36 surgical patients ±s

表5 36 例手術患者CTCs 與病理分期的關系Tab.5 Relationship between CTCs and pathological stage in 36 surgical patients ±s

注：與Ⅰ期相比，aP ＜0.05；與Ⅱ期相比，bP ＜0.05

病理分期Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期Ⅳ期F 值P 值例數6 12 14 4年齡（歲）72.64±4.12 73.42±4.10 73.69±4.13 74.07±4.21 0.084 0.968 PSA（ng/mL）14.16±2.27 19.53±2.65a 22.46±4.94a 38.57±5.17ab 34.76＜0.001 CTCs（個）5.18±2.03 6.31±2.11 7.64±1.84 8.79±1.02b 3.513 0.026

3 討論

CTCs 是指從腫瘤原發灶或者轉移灶經過主動或者被動方式入血并逃過了免疫殺傷而存活下來的腫瘤細胞［8］。作為液體活檢中應用較早的一種，CTCs 檢測可以及時反映原發腫瘤的發展情況，輔助判斷病情的進展，并且具有無創、便捷、可重復檢測等優勢［9］。

圖1 CTCs 與PSA（A）和Gleason 評分（B）的相關性Fig.1 Correlation of CTCs with PSA（A）and Gleason score（B）

前列腺穿刺活檢是前列腺癌診斷的金標準，臨床上對于是否行前列腺穿刺活檢主要是通過PSA 水平來界定的［10］，但PSA 是組織特異性而非腫瘤特異性，并且干擾PSA 結果的因素較多，國內有研究［11］顯示PSA 在10 ～20 ng/mL 之間的258 例穿刺活檢患者，癌檢出率僅為33.3%，并且前列腺穿刺活檢作為一種侵入性的檢查方法，無法監測原發腫瘤的變化。而CTCs 由于和腫瘤原發灶具有相似的基因型和表型，相較于PSA 檢測具有更高的特異性，相較于前列腺癌穿刺活檢，CTCs 檢測更快捷，微創，并且能動態反應病情變化［12-13］。從1869年ASHWORTH［14］首次發現CTCs 至今已有150 余年，但由于檢測技術不足，CTCs 在臨床中的應用受到限制。近年來，隨著現代檢測技術的發展，CTCs 在腫瘤的早期診斷、轉移監測和療效觀察以及腫瘤個體化治療等各方面的應用均得以迅猛發展［15-16］。本研究基于CanPatrolTM二代CTC 檢測技術檢測CTCs，是應用免疫去除結合納米過濾法的第二代CTCs 富集技術，不需要依靠特異抗體捕獲，對腫瘤細胞的回收率超過80%。本研究結果顯示，研究組患者CTCs 陽性率顯著高于對照組，前列腺癌轉移患者CTCs 陽性率顯著高于非轉移患者。以病理結果為金標準，利用四格表預測CTCs 對前列腺癌的診斷價值，結果顯示CTCs、PSA對前列腺癌的診斷靈敏度分別88.46%、85.89%，特異度分別為74.28%、65.71%，準確率分別為84.07%、79.64%，提示血清PSA、CTCs 對前列腺有一定的診斷價值，且CTCs 對前列腺癌的診斷價值優于PSA。惡性腫瘤需依賴宿主生長，在增殖過程中會引起低白蛋白血癥以及貧血等癥狀，造成患者營養不良、病情加重，而腫瘤患者約20%直接死于營養不良［17-18］。有研究［19］表明，ALB 與HB 作為評估營養狀況與貧血的主要指標，與腫瘤患者術后并發癥以及死亡率有關。本研究顯示，前列腺癌CTCs 陽性組HB、ALB 水平明顯低于CTCs 陰性組，提示CTCs 陽性組患者營養狀況較差，預后不佳。有研究［20］報道，PLT 的升高在惡性腫瘤發展和轉移過程中起促進作用，FIB、D-D 的升高與惡性腫瘤疾病嚴重程度密切相關。本研究中，CTCs 陽性組PLT、FIB、D-D 較CTCs 陰性組明顯升高，說明CTCs陽性患者血液處于高凝狀態，可促進腫瘤的浸潤和轉移。因此，通過對CTCs 計數的檢測有助于早期發現前列腺癌患者血液的高凝狀態，并通過CTCs 計數的變化間接的預測腫瘤的浸潤與轉移。有學者研究［21］發現，前列腺癌骨轉移患者AKP 水平明顯升高，而AKP 是預測前列腺癌骨轉移的獨立預測因素。LDH 是糖酵解的主要酶類，由于惡性腫瘤細胞的能量需求較正常組織細胞顯著增多，細胞通透性增加，導致LDH 酶進入血循環，從而引起血清LDH 水平升高［22-23］。本研究結果顯示與CTCs 陰性組相比，CTCs 陽性組AKP、LDH 水平明顯升高，提示CTCs 陽性組患者腫瘤惡性程度較高，病情較CTCs 陰性組更嚴重，可能作為輔助判斷前列腺癌進展的潛在指標。

PSA 一直以來都是作為前列腺癌診斷以及預后判斷的重要指標之一，有研究［24］證實CTCs 水平與PSA水平呈正相關。本研究中，CTCs水平與PSA呈顯著正相關，與上述文獻報道一致，提示CTCs可以作為前列腺癌的早期診斷以及預后評估的潛在指標。本研究還發現，CTCs 水平與Gleason 評分呈現顯著正相關，且CTCs 與病理分期具有明顯相關性，與CIELIKOWSKI 等［25］研究結果一致。隨著病理分期的增加，CTCs 個數也明顯增加，但CTCs能否作為獨立預測因素或者與某些預測因子聯合用于前列腺癌Gleason 評分以及病理分期評估仍需要臨床大樣本的試驗研究。

CTCs 作為一種無創、便捷、可重復檢測的新型診斷指標，對前列腺癌的早期診斷、療效觀察、預后判斷具有一定的臨床價值。目前關于CTCs 檢測在臨床實際應用中最大的問題是檢測技術的局限性，以及需要更大樣本量對實驗結果進行驗證，以期得到更客觀準確的結論，這也是本研究組后續研究的方向。