miRNA-192在肝細胞癌組織中的表達及意義

孫玉珍 李世朋 趙建龍

(1阜外華中心血管病醫院，河南 鄭州 450000；2焦作市人民醫院普外科；3河南科技大學醫學院)

miRNA家族是長度約22個堿基的小分子非編碼單鏈RNA，具有廣泛性和多樣性的特點，能夠阻遏mRNA的翻譯，進而影響蛋白質的表達。人們發現miRNA具有重要的監管職能并能調控多種生物進程，其表達的改變能夠導致癌癥的發生及進展〔1〕。其中miRNA-192在腫瘤的發生發展及轉移過程中所起的作用受到人們的廣泛關注，但miRNA-192在肝細胞癌中的表達情況及臨床意義還需進一步研究。本研究探討miRNA-192在肝細胞癌中的表達及意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集河南科技大學第一附屬醫院2009年6月至2013年 8月接受肝細胞癌手術治療的肝細胞癌組織43例及癌旁組織33例，組織學分級按Edmondson-Steiner分級法分為Ⅰ～Ⅳ級，Ⅰ～Ⅱ級歸為高中分化組，共31例，Ⅲ～Ⅳ級歸為低未分化組，共12例。TNM分期按照UICC/AICC 2010年標準，Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期18例。有淋巴轉移6例，無淋巴轉移37例。所有患者術前未行放化療，臨床資料完整。另取正常肝臟組織25例作為對照。病理診斷由兩位病理科醫生采用雙盲法認定。

1.2主要試劑與儀器 mirVanaTM miRNA提取和分離試劑盒(Ambion，美國)，Taq DNA 聚合酶、限制性核酸內切酶和T4 DNA 連接酶(Fermentas，深圳)，M-MLV反轉錄酶(Promega 美國)，RiboLock RNA 酶抑制劑(Fermentas，深圳)；DYY-7型轉移電泳儀(北京市六一儀器廠)，PTC-200型PCR熱循環儀(Bio-Rad，美國)，iQ5熒光定量PCR檢測系統(Bio-Rad，美國)，LabWorksTM凝膠成像及分析系統(UVP，美國)，F-4500型突光檢測儀(HITACHI，日本)，UV-2000型可見/紫外分光光度計(UNICO，美國)。地高辛標記的miRNA-192探針(稀釋至100 nmol/L)，原位雜交試劑盒(博士德，武漢)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色液試劑盒(中杉金橋，北京)，其余試劑為分析純。

1.3原位雜交 原位雜交檢測 microRNA-192，將組織切片脫蠟和水化，蛋白酶 K(1 μg/ml)室溫孵育30 min。滴加0.1 mol/L甘氨酸-磷酸鹽緩沖液(PBS)終止消化，滴加預雜交液，預雜交30 min。0.2×SSC緩沖液沖洗后滴加雜交液，90℃孵育10 min，將切片置于盛有0.2×SSC緩沖液的濕盒中37℃孵育過夜 。沖洗后滴加封閉液，37℃孵育30 min。滴加兔抗地高辛IgG，濕盒37℃孵育30 min。PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶(HRP)山羊抗兔IgG，濕盒37°孵育30 min。滴加DAB顯色。雜交過程以U6探針(1 nmol/L)作為陽性對照，去除探針作為陰性對照。microRNA-192以腫瘤細胞質中出現明顯的棕黃色顆粒為陽性染色。采用半定量積分法判斷結果。染色強度分級：1分，無染色，為陰性；2分，低等強度染色，為弱陽性；3分，中等強度染色，為中等陽性，>3分，強染色，為強陽性。陽性細胞數分級：1分為陽性表達率<10%；2分為陽性表達率 10%～50%；3分為陽性表達率>50%。以上兩項分數相乘，得分1～3分者為低表達，>3分為高表達。

1.4實時定量RT-PCR 將組織脫蠟及水化，蛋白酶K消化后，按mirVanaTM miRNA提取和分離試劑盒說明書提取總miRNA 。根據miRNA-192的基因信息及內參U6的基因信息，運用Primer Premier 5.0軟件分別設計RT及PCR引物，miRNA-192 RT引物序列：5′-GAGGCACAGCUUGACCUAUG AAUUGCAGCCAGGCUCCGUGUUGAACUGGAUACUU AACGUCGGUC GGCTGT-3′；PCR引物序列：正義鏈5′-CTGACCTATGAATTG-3′，反義鏈5′-GACCTATGAATT-3′。U6 RT引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；PCR引物序列正義鏈5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反義鏈5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。按照 Taqman microRNA assay 熒光實時定量 PCR 試劑盒的方法，首先對各組織的miRNA進行逆轉錄，然后在實時定量PCR儀上進行熒光實時定量 PCR，條件：50℃，10 s；95℃，9 min；95℃，12 s；循環35次，60℃，1 min，50 μl反應體系。iQ5熒光定量PCR檢測系統讀出各組織的 Ct 值，miRNA-192相對表達量的 microRNA分析用 U6 作內參，結果用 ABI自帶軟件分析。

1.5統計學方法 應用SPSS19.0 統計軟件進行t、χ2檢驗。

2 結 果

2.1原位雜交的結果分析 miRNA-192探針結果顯示呈棕黃色顆粒的陽性信號，定位于胞質，見圖1。miRNA-192在正常肝組織、癌旁和肝細胞癌組織中的表達率差異有統計學意義(χ2=23.698，P<0.000 1)，見表1。

圖1 miRNA-192在不同組織中的表達(DAB，×200)

表1 miRNA-192在不同組織中的表達(n)

2.2RT-PCR的結果分析 在肝細胞癌組織中 miRNA-192的含量(1.83±0.43)顯著低于正常肝臟組織(4.05±0.32，P<0.01)及癌旁組織(2.89±0.19，P<0.05),且癌旁組織miRNA-192的含量明顯低于肝細胞癌組織(P<0.05)。

2.3miRNA-192的表達與肝細胞癌臨床病理參數的關系 miRNA-192在低未分化肝細胞癌中的陽性率明顯低于高中分化者(P<0.05)；Ⅲ～Ⅳ期肝癌組織中miRNA-192的表達水平低于比Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)；有淋巴結轉移肝癌中的陽性率明顯低于無淋巴結轉移者(P<0.05)，見表2。

表2 肝細胞癌中miRNA-192表達與臨床病理學參數的關系

3 討 論

肝細胞癌占全世界原發性肝癌的70%～85%〔2〕，在我國約占90%〔3〕。研究證明，肝細胞癌發生過程中有的microRNA含量上升，有的microRNA含量下降，異常表達的microRNA影響其發生侵襲性和預后〔4，5〕，它們能通過特異性結合于蛋白mRNA的3端非編碼區(3′-UTR)，從而影響該蛋白的表達。miRNA-192(MI0000234)定位在11號染色體(64658609-64658718)，在肝臟、結腸和腎臟組織中表達豐富〔6〕。miRNA-192目前已被證實在多種腫瘤中均存在表達異常的現象，提示其參與了腫瘤發生發展及侵襲轉移的生物功能。吳蔚蕓等〔7〕采用實時定量RT-PCR技術發現結直腸癌組織中miRNA-192的表達下調，顯著低于非腫瘤組織，并發現miRNA-192的低表達與淋巴結轉移及遠處轉移有關；Feng等〔8〕的研究表明與正常肺組織相比，miRNA-192在肺癌組織中表達下調，在體外實驗中，過表達miRNA-192通過作用于RB1基因可以抑制肺癌細胞的增殖和促進凋亡。李娟〔9〕發現在胃癌miRNA-192低表達組中，miRNA-192的低表達與腫瘤的大小、大體分型和pT分級相關。腫瘤越大，分型分級越重，miRNA-192表達量越低。謝瓊慧等〔10〕初步證實HepG2細胞中miRNA-192的下調能夠降低p53和CD-KNIA的表達水平，抑制p53介導的細胞周期阻滯，促進癌癥的發生。下調RB1表達很可能是miRNA-192促進HepG2細胞凋亡的機制之一〔11〕。於雷〔12〕利用microRNA芯片發現miRNA-192在肝癌組織中表達下調，體現出抑癌作用，腫瘤組織中miRNA-192與患者術后無瘤生存率顯著相關。本結果說明miRNA-192表達水平的下降與肝細胞癌的組織類型、TNM分期、淋巴轉移情況存在相關性。這些特征都與腫瘤的發展及不良生物學行為密切相關，其中淋巴結轉移更是患者預后不良的重要標志，因此我們推測miR-192表達下調在肝細胞癌發生發展、侵襲轉移過程中起重要作用，并影響肝細胞癌患者的遠期生存預后。microRNA-192 有望作為一種預測肝細胞癌病情進展及預后的潛在生物學標志物。