阿爾茨海默病小鼠海馬組織差異表達miRNA-687的生物信息學分析

吳俊 張穎

(江蘇省疾病預防控制中心毒理與風險評估研究所，江蘇 南京 210009)

阿爾茨海默病(AD)是一種以進行性認知障礙、記憶力損害和精神行為異常為主的中樞神經系統退行性病變〔1〕。我國的人口老齡化導致AD患者數目增長迅速，我國每7 s就有一個人患上AD，平均生存期僅有5.9年〔2〕。AD的發病機制復雜且尚不明確，文獻報道，包括β-淀粉樣蛋白假說、“Tau蛋白”假說在內的多種機制研究〔3,4〕。MicroRNA是一類長度為19～25個核苷酸的小分子RNA。研究發現microRNA與AD的發生和發展有密切聯系，microRNA可能通過直接或間接調節β-淀粉樣蛋白代謝、軸突可塑性等方式參與其中〔5,6〕。隨著現代生物技術的迅速發展如基因芯片等，為全面研究AD發生的分子機制提供了新手段。本研究應用生物信息學方法分析AD模型小鼠海馬組織差異表達的相關microRNA，并以其中一個microRNA為靶點，挖掘其可能參與的調控機制，為進一步闡明AD發生的分子機制提供新的研究線索。

1 材料與方法

1.1材料 從美國國立生物技術信號中心(NCBI)公共數據平臺GEO檢索“Alzheimer′s disease〔All Fields〕AND microRNA〔All Fields〕AND Hippocampus〔All Fields〕”，選擇物種為小鼠，并下載基因芯片數據集GSE48028。GSE48028包含來源于6只AD模型小鼠和6只對照小鼠雙側海馬組織標本差異表達的microRNA信息。

1.2microRNA篩選及數據處理 使用GEO2R在線工具分析和查找差異表達的microRNA，以|Log FC|>1.5和P<0.05對數據進行標準化處理。

1.3靶基因預測 采用TargetScan7.2靶基因預測工具和miRDB在線靶基因預測網站，選擇物種為小鼠，輸入miRNA-687運行后導出該microRNA的靶基因預測結果，并把2個靶基因預測工具預測出的靶基因取交集。

1.4富集分析(GO)和通路分析(KEGG) DAVID是一個在線生物信息數據庫，其中GO用于注釋基因生物學過程，KEGG用于預測其相關信號通路。利用DAVID數據庫，以小鼠基因組數據為背景，從生物學過程、細胞組分和分子功能3方面富集并分析上述預測得到的靶基因，并利用KEGG功能進行分析。應用R軟件3.5.3版對分析結果進行整理。

1.5靶基因相互作用網絡分析 蛋白質相互作用網絡預測將miRNA-687的靶基因導入STRING在線分析網站，設置可信度為0.4則認為具有統計學意義，得出其靶基因編碼蛋白之間相互作用網絡圖。Cytoscape3.7.1軟件用于可視化分子相互作用網絡，分析網絡內靶基因編碼蛋白的連通度。以degree cutoff =2，node score cutoff =0.2，k-core =2，max.Depth=100為標準，利用Cytoscape內的MCODE插件對互作網絡進行評分，得出評分表較高的蛋白質互作網絡，找出關鍵靶基因。使用在線Uniprot數據庫對互作節點度≥4的靶基因進行功能分析。

2 結 果

2.1篩選出差異表達的microRNA 計算模型組和對照組樣本間|Log FC|和P值，篩選出下調microRNA共8個：miRNA-693-5p、miRNA-707、miRNA-679、miRNA-878-3p、miRNA-701、miRNA-465c-5p、miRNA-878-5p、miRNA-687，上調microRNA共4個：miRNA-376a、miRNA-362-3p、miRNA-455、miRNA-883a-5p，見表1。

表1 差異表達的microRNA篩選結果

2.2miRNA-687的靶基因預測 miRNA-687被認為是腎缺血再灌注損傷的關鍵調節因子和治療靶點，但對其在神經系統方向及更為深入的相關機制和功能研究報道很少，本文選擇miRNA-687作為研究對象預測其靶基因，為進一步研究miRNA-687的機制和功能提供線索。利用TargetScan靶基因預測工具發現miRNA-687的靶基因2 137個，miRBase在線預測網站預測靶基因230個，對2種工具預測出的靶基因取交集得到172個共同的靶基因，Peg10，Sos2，Atp11c，Irx2，Paqr8，Pde3b，Homer1，Cpeb3，Usp53，Hormad2，Dcaf12l2，Vps26b，Slc24a2，Cyp7b1，Suds3，Plekho1，Slc2a4，Met，Ninj2，Sstr1，Adam10，Mycbp2，Sfrp4，Ascl2，Dennd5b，Scarb2，Klf12，Exph5，Ptpn12，Crls1，Cherp，Dld Prr7，span2，Rasl11b，P2ry13，Flvcr2，Six3，Iqsec1，Vax1，Nufip2，Naa15，Tbx20，Pus1，Fam168b，Riok3，St8sia4，Fbxo28，Htr7，Pten，Prmt3，Luzp1，Clock，Itln1，Fuca2，Pex5l，Sept7，Kif2a，Ankrd9，Fgfbp1，Nid1，Ccser1，Fut9，Cdh6，B3gat1，Tmtc4，Plxnb1，Map3k1，Rnf138，Nfya，Ppm1e，L2hgdh，Ywhaz，Cxadr，Nol4，Vps28，Dido1，Fam84b，Tmed7，Twistnb，Gfm1，Tmx1，Srsf10，Sgpp2，Igsf1，Gpc6，Tnfsf4，Krtap26-1，Rassf5，Lrba，Tlk1，Pias2，Chic1，Cebpg，Tram1l1，Msl2，Kcnd3，Abi1，Atxn1l，Tapt1，Eva1a，Six1，Ctxn3，Ptges3，Aspn，Gm2a，Zkscan8，Clic5，Slc30a9，Pdcd6ip，Prkca，Bcar3，Mak16，Ubox5，Maml2，Nrl，Amacr，Ldha，Nlrc5，Was，Anxa3，Ska3，Grip1，Ficd，Pcyox1，Syap1，Nr4a3，Srgn，Sin3a，Tm2d2，Dennd6a，Ranbp3l，Rp1，Mars2，Fgf20，Cadm2，Arhgef38，Clec7a，Insr，Pank3，Gtf2a1，Bag4，Col19a1，Camk4，Vps33b，Tmx4，Mtcp1，Megf9，Gpr161，Rap2c，Igfbp4，Tdrd6，Tctex1d1，Sdhd，Zscan22，Rrm2b，Itga4，Slain2，Ppp1r16b，4-Mar，Rarb，Fance，Itgb1bp2，Tmem130，Metap2，Serpinb8，Nfib，Mthfr，Stk3，Sp1，Trpm3，Arfgef1，Rora。

2.3miRNA-687靶基因的GO和KEGG 通過GO靶基因的主要生物學過程、分子功能及細胞組件，整理了排名前十位且差異有統計學意義的結果，發現其們主要參與了RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、凋亡過程、樹突棘形態發生、DNA轉錄正調控、細胞增殖負調控等生物學過程；分子功能包括蛋白結合作用、核心啟動子序列特異性DNA結合、調節轉錄因子活性、調節鳥苷核苷酸交換因子活性等功能；而細胞組成分析顯示這些基因大多集中在投射神經元、再循環內體、突觸等區域。見圖1。

圖1 miRNA-687靶基因的GO

KEGG結果顯示，差異有統計學意義的信號通路包括：(1)PI3K-Akt信號通路(mmu04151)，該通路由9個miRNA-687的靶基因參與，分別為Prkca、Ywhaz、Sos2、Met、Mtcp1、Itga4、Fgf20、Pten、Insr。(2)非小細胞肺癌(mmu05223)，該通路由4個靶基因參與，分別為Prkca、Rassf5、Sos2、Rarb。(3)Ras信號通路(mmu04014)，該通路由7個靶基因參與，分別為Prkca、Rassf5、Htr7、Sos2、Met、Fgf20、Insr。(4)FoxO信號通路(mmu04068)，該通路由5個靶基因參與，分別為Slc2a4、Sos2、Homer1、Pten、Insr。

2.4miRNA-687靶基因相互作用網絡分析 利用STRING數據庫分析得到網絡關系如，顯示172個節點之間存在82種關系，其中Suds3與Sin3a、Abi1與Was、Clock與Rora、Mak16與Twistnb、Fuca2與Gm2a、Met與Plxnb1、Grip1與Prkca、Gtf2a1與Sp1、Adam10與Rap2c、B3gat1與Gpc6這十對基因之間的聯系最為密切。插件MCODE分析后發現符合參數要求的有3個子模塊，第1、2個子模塊分別由4個節點和6條邊組成，第3個子模塊由3個節點和3條邊組成，Pten、Met、Insr、Ptpn12、Fuca2、Eva1a、Adam10、Igfbp4這8個靶基因在蛋白質互作網絡中起關鍵作用，是受miRNA-687調節的關鍵基因。

3 討 論

AD是老年人最常見的中樞神經系統退行性疾病，以β-淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑、tau蛋白過度磷酸化形成神經原纖維纏結及大量神經元死亡為病理特征。現已明確，microRNA可與靶基因mRNA的3′非編碼區特異性結合，負向調控靶基因的轉錄后水平，參與細胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學過程〔7〕。基因調控與AD的發生發展有密切聯系。研究顯示microRNA與β-淀粉樣蛋白致AD的機制有關，如在AD小鼠模型中，上調的miR-331-3p可通過調控靶基因的表達引起β-淀粉樣蛋白升高〔8〕。此外，microRNA與tau蛋白的磷酸化密切相關，Dickson等〔9〕發現晚期AD患者富集tau蛋白的腦組織中miRNA-512的表達降低，研究進一步發現miRNA-512通過靶向細胞型Fas相關死亡區域的β白細胞介素(IL)-1轉換酶抑制蛋白從而負調控tau蛋白表達。

miRNA-687位于小鼠的第14號染色體上，關于miRNA-687的研究主要集中于急性腎損傷方面〔10〕。有文獻報道miRNA-687在腎缺血再灌注小鼠腎臟組織和缺氧狀態下的腎臟細胞中表達上調〔11〕。miRNA-687抑制了磷酸酶張力蛋白同系物基因Pten的表達從而促進了細胞周期進展和凋亡。而其在神經系統方面及更為深入的相關機制和功能研究報道很少，通過靶基因預測、GO、KEGG，更好地探討miRNA-687的分子機制和生物學功能。綜合GO結果可以推測，miRNA-687可能通過調控集中于投射神經元、再循環內體、突觸等區域的靶基因調控RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄、參與細胞凋亡、調節樹突棘形態發生等生物學過程影響AD的發生發展。KEGG提示miRNA-687靶基因集中于PI3K-Akt、Ras等信號通路。內質網應激與AD患者神經元死亡有關，而Pten抑制劑可以通過激活APP/PS1轉基因AD模型小鼠的PI3K/AKT信號通路來抑制內質網應激從而起到神經保護作用〔12〕。此外，淀粉樣前體蛋白可激活Ras信號通路從而促進了神經退行性疾病的發生〔13〕。

STRING在線分析網站和Cytoscape軟件預測Pten、Met、Insr、Ptpn12、Fuca2、Eva1a、Adam10、Igfbp4這8個靶基因受miRNA-687調節的關鍵基因。磷酸酶及張力蛋白同源基因Pten定位于染色體10q23.3，由9個外顯子組成，編碼由403個氨基酸組成的蛋白質，具有磷酸酯酶活性。除上述Pten抑制劑通過PI3K/AKT信號通路來抑制內質網應激外，Pten能有效避免AD模型中突觸功能失常和認知功能缺陷〔14〕。Met是受體型酪氨酸激酶RTK家族成員之一，其配體為間質起源的細胞產生的肝細胞生長因子Hgf，二者結合組成Met/Hgf信號系統參與葡萄糖代謝、細胞增殖、神經保護和神經再生〔15〕，在AD患者腦組織海馬神經元中Met的表達呈下降趨勢，這種下降可能對AD患者神經元的存活產生不利影響。AD的主要病理特征包括腦內毒性β-淀粉樣蛋白沉積和神經元大量消失死亡。而β-淀粉樣蛋白是由淀粉樣前體蛋白APP 降解而來。Adam10屬于Ⅰ類單個跨膜蛋白，促進其向細胞的轉運及過表達能夠加強對APP的降解。臨床上細胞α分泌酶可用于治療AD患者，而Adam10不僅可以作為主要的α分泌酶，還可以通過與底物的相互作用影響Tau蛋白、突觸功能、海馬神經發生和膠質生成〔16〕。上述研究均為miRNA-687及受其調節的靶基因作為AD研究的新靶點提供了線索，但仍有待實驗驗證。

綜上，本研究通過應用生物信息學方法對GEO數據庫中AD小鼠海馬組織差異表達的microRNA數據集進行挖掘，成功篩選了12個差異表達microRNA，對其中研究較少的miRNA-687進行靶基因預測后，對這些靶基因進行GO和KEGG，初步明確了其功能和相關的信號通路。此外，通過構建蛋白質互作網絡圖，從中選出了8個受miRNA-687調節的關鍵基因，為進一步研究miRNA-687及其他差異表達的microRNA參與調節AD發生的機制研究提供了新靶點。