氧化苦參堿調節CIA小鼠濾泡輔助性T細胞的研究①

曹 干 王寧萍 崔振華 王佩佩 楊勇婭 張艷麗

(寧夏醫科大學基礎醫學院病原生物學與免疫學系，銀川 750004)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是慢性、進行性、侵蝕性自身免疫性疾病，以關節滑膜炎癥為特征，其發病機制通常認為與CD4+T淋巴細胞分化異常有關。濾泡輔助性T(T follicular helper，Tfh)細胞是可促進淋巴濾泡生發中心形成、輔助B細胞活化、增殖、分化并產生高親和力抗體的CD4+T細胞，研究提示Tfh細胞在RA的炎癥形成、關節軟骨及骨質破壞、骨侵蝕中具有重要作用[1，2]。RA治療多使用非甾體類抗炎藥和糖皮質激素，但僅能緩解癥狀且副作用較多。生物制劑治療逐漸被關注，已取得一定療效，如英夫利昔單抗(Infliximab)，但價格昂貴。本課題組前期研究發現從寧夏道地藥材苦豆子中提取的氧化苦參堿(oxymatrine，OMT)在小鼠體內顯示了較好的抗炎作用，可通過調節Treg/Th17細胞平衡起抗RA作用，但作用機制尚不明確[3，4]。本實驗通過構建DBA/1J小鼠膠原誘導性關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型，明確OMT治療效果，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 50只雄性SPF級DBA/1J小鼠購自卡文斯實驗動物有限公司(No.201708981)，6～7周齡，體質量18～22 g。飼養于我院動物室潔凈柜，室溫20～25℃，相對濕度55%，自由飲食。DBA/1J小鼠隨機分為6組：正常組、模型組、地塞米松組、OMT高、中、低劑量組，每組7只。實驗中意外死亡的小鼠或造模未成功的小鼠用同批次其余8只小鼠做相應補充。

1.1.2藥物 OMT(批號：20161028)購自寧夏紫荊花藥業股份有限公司，純度99.18%；地塞米松注射液[5 mg/(2 ml·支)]購自山東辰欣藥業集團。根據文獻[5]確定本實驗OMT高劑量組(OMT-H)OMT濃度為180.0 mg/(kg·d)，中劑量組(OMT-M)為90.0 mg/(kg·d)，低劑量組(OMT-L)為45.0 mg/(kg·d)。用生理鹽水溶解OMT并過濾，4℃保存待用。

1.1.3試劑 牛源性Ⅱ型膠原購自Chondrex公司；完全及不完全弗氏佐劑購自Sigma公司；Percpcy5.5標記的Anti-mouse-CD4、FITC標記的Anti-mouse-CXCR5、PE標記的Anti-mouse-ICOS購自BD公司；小鼠IL-21 ELISA試劑盒購自欣博盛公司；小鼠血清Ⅱ型膠原抗體(CⅡ-Ab)ELISA試劑盒購自上海寶曼生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1建模 將2.0 mg/ml的牛源性Ⅱ型膠原和等體積完全弗氏佐劑混合并完全乳化后，皮下多點注射于各組小鼠背部近尾1～2 cm處，0.1 ml/只，正常組注射等體積生理鹽水，21 d后同法加強免疫。造模后第15天，陽性藥物組腹腔注射地塞米松，2.8 mg/kg，1次/d，持續1周，1周后以1.4 mg/kg 劑量維持；OMT高、中、低劑量組依照方案分別行腹腔注射；正常組及模型組腹腔注射等體積生理鹽水。治療30 d后于第45天依據寧夏醫科大學倫理委員會相關規定處死全部小鼠。

1.2.2觀測CIA小鼠關節腫脹度 每隔3 d由專人使用游標卡尺測量并記錄各組小鼠右爪和右踝關節厚度，連續測量至第45天，計算CIA小鼠關節腫脹程度(mm2)=右爪腫脹(mm)×右踝腫脹(mm)。

1.2.3評估CIA小鼠關節炎指數(arthritis index，AI) 小鼠關節腫脹程度參考文獻[6]進行分級，每只足爪關節的評分最高為4分：0分為正常，無紅腫跡象；1分為1個或多個小趾關節輕微紅腫；2分為足跖和趾關節出現腫脹；3分為小鼠踝關節及以下足爪出現紅腫；4分為小鼠整個足爪以及踝關節腫脹，最高分數為16分。

1.2.4流式細胞術檢測小鼠脾Tfh細胞比例 各組小鼠脫頸處死后無菌摘取脾臟并采用淋巴細胞分離液制備單個核細胞懸液，細胞濃度為2×106個/50 μl。避光加入Percpcy5.5標記的Anti-mouse-CD4、FITC標記的Anti-mouse-CXCR5、PE標記的Anti-mouse-ICOS抗體，同時設空白細胞管和單抗體標記管，錫紙包裹置4℃冰箱孵育30 min。洗滌2次后用300 μl PBS混勻重懸細胞。300目濾膜過濾后，流式細胞術檢測，Flowjo7.6.5軟件分析數據。

1.2.5HE染色法觀察CIA小鼠關節組織情況 取小鼠右后肢關節制作蠟塊，切成4 μm薄片行HE染色，顯微鏡下觀察關節滑膜組織形態結構。

1.2.6ELISA法檢測小鼠血清IL-21和CⅡ-Ab含量 小鼠摘眼球取血，離心取血清，按ELISA試劑盒內說明書檢測。

2 結果

2.1OMT緩解CIA小鼠的關節炎癥狀 治療21 d后OMT高、中劑量組小鼠關節紅腫情況緩解，細胞排列較規則且增生情況減輕、淋巴細胞浸潤減少、滑膜層數變薄，OMT低劑量組未見明顯改善，地塞米松組有少量淋巴細胞浸潤，與正常組相比差異無統計學意義。見圖1。

圖1 CIA小鼠的關節炎表現(×100)Fig.1 Arthritis in CIA mice(×100)Note:1.Normal;2.Model;3.DXM;4.OMT-H;5.OMT-M;6.OMT-L.

2.2OMT緩解CIA小鼠關節腫脹度并降低AI 地塞米松組、OMT高劑量組小鼠在首次免疫后第32天關節腫脹明顯緩解，治療3周后，地塞米松組、OMT高、中、低劑量組小鼠關節腫脹明顯緩解。模型組小鼠AI隨時間延長逐漸升高，第25天時達到高峰，后隨給藥時間延長下降，與模型組相比差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。

圖2 CIA小鼠的關節腫脹度及關節炎指數評分Fig.2 Joint swelling degree and arthritis index score of CIA miceNote:1.Normal;2.Model;3.DXM;4.OMT-H;5.OMT-M;6.OMT-L.*.P<0.05 vs Normal group；#.P<0.05 vs Model group.

2.3OMT降低CIA小鼠脾Tfh細胞比例 流式細胞術檢測小鼠脾CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細胞百分比結果顯示，與正常組相比，模型組CD4+ICOS+CXCR5+Tfh細胞百分比顯著升高(P<0.01)，地塞米松組、OMT高、中劑量組CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細胞百分比顯著下降(P<0.01，圖3)。

圖3 流式細胞術檢測脾CD4+CXCR5+ICOS+ Tfh細胞百分比Fig.3 Flow cytometry was used to detect percentage of spleen CD4+CXCR5+ICOS+ Tfh cells

2.4OMT抑制CIA小鼠血清IL-21、CⅡ-Ab表達 與正常組相比模型組CIA小鼠血清IL-21和CⅡ-Ab表達顯著升高(P<0.01)，OMT治療30 d后，地塞米松組、OMT高、中劑量組小鼠血清IL-21和CⅡ-Ab水平降低(P<0.05)，且地塞米松組下降幅度大于OMT高劑量組，見圖4。

圖4 ELISA檢測CIA小鼠血清IL-21和CⅡ-Ab表達Fig.4 ELISA to detect serum IL-21 and CⅡ-Ab expressions in CIA miceNote:1.Normal;2.Model;3.DXM;4.OMT-H;5.OMT-M;6.OMT-L.*.P<0.05 vs Normal group；#.P<0.05 vs Model group.

3 討論

Tfh細胞是位于次級淋巴組織(secondary lymphoid organs，SLOs)生發中心的可輔助B細胞產生抗體的CD4+T細胞，其表達的特征性膜表面分子主要包括：趨化性細胞因子受體(CXC chemokine receptor 5,CXCR5+)、誘導共刺激分子(inducible costimulatory molecule,ICOS)、程序性細胞死亡蛋白(programmed cell death protein 1,PD-1)、CD40L等，高表達鋅指結構轉錄因子Bcl-6(B-cell lymphoma-6)，可分泌IL-21[7，8]。Tfh細胞通過表達CXCR5識別其配體CXCL13并結合引導Tfh細胞遷移至淋巴濾泡形成生發中心。ICOS可與主要表達于B細胞的ICOS配體結合，促進Tfh細胞分泌炎癥細胞因子IL-21。IL-21通過與生發中心B細胞表面或Tfh細胞自身表達的IL-21受體結合，促進漿細胞分化產生大量抗體并誘導Tfh細胞表達CXCR5并遷移至生發中心，維持T-B細胞動態平衡[9]。Bcl-6是初始CD4+T細胞分化為Tfh細胞的必要條件，且可誘導CXCR5表達，缺乏Bcl-6則T細胞生發中心無法形成，亦不能分化為Tfh細胞，影響Th1、Th2、Th17細胞分化[10]。由于Tfh細胞對生發中心B細胞的多種生物學作用，決定其數量或功能的改變都將引起免疫應答紊亂，導致免疫系統疾病[11]。

RA的病因和發病機制尚不明確，但不同亞群的CD4+T細胞一直備受關注[12，13]。研究表明Tfh細胞在CD4+T細胞中的比例升高或其功能發生紊亂參與RA發生發展。Wang等[14]發現初發RA患者外周血存在高比例循環的CD4+CXCR5+、CD4+CXCR5+ICOS+和CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細胞，且RA患者血清高水平IL-21與疾病活動度呈正相關。Ma等[15]證實RA患者與健康志愿者相比，其外周血循環CD4+CXCR5+ICOShighTfh細胞增多，并伴隨抗環瓜氨酸多肽抗體(anti-CCP)水平升高。Jang等[16]構建IL-21受體缺陷的K/BxN小鼠RA模型，發現IL-21水平下降且Tfh細胞數量減少導致RA進展減緩。OMT是從寧夏道地中草藥苦豆子中提取的單體堿，前期實驗結果提示OMT可緩解CIA大鼠關節腫脹、降低關節炎指數并能調控Th17細胞數量，因此本團隊主要研究OMT能否作用于Tfh細胞而干預RA發生發展。本實驗通過建立CIA小鼠模型觀察Tfh細胞在RA發生發展中的作用，結果表明CIA模型組小鼠脾CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細胞比例增高、血清IL-21水平升高、產生大量CⅡ-Ab，高、中劑量OMT可抑制Tfh細胞過度增殖和活化，抑制IL-21的高水平分泌及大量抗體的產生，HE染色結果顯示OMT緩解CIA小鼠關節組織的炎癥病理變化，提示OMT可能對Tfh細胞具有調控作用從而治療RA。但OMT是如何調控Tfh細胞表面膜分子表達和細胞因子分泌從而達到治療RA的免疫學分子機制有待進一步研究。