槲皮素調控AMPK/mTOR通路對肺癌A549細胞自噬的影響①

文蘭香 覃世運 陳麗君

(海南省第三人民醫院腫瘤中心，三亞 572000)

肺癌是發生于支氣管黏膜上皮的惡性腫瘤，發病率居男性惡性腫瘤的首位，近年來在女性中發病率也迅速提高，嚴重危害人類生命健康[1,2]。臨床上主要通過外科手術以及化療治療肺癌，但持續使用化療藥物會造成骨髓抑制，且易產生耐藥性[3]。中藥因具有保護骨髓、毒性較小等優勢在現代醫學研究中占據一定地位，因此尋求毒副作用小、肺癌治療效果顯著的中醫藥物質成為研究重點之一[4]。槲皮素是在植物中廣泛存在的黃酮類物質，研究顯示其可能通過影響癌細胞自噬，在抗腫瘤中發揮重要作用[5,6]。自噬是真核細胞中存在的生理現象，是蛋白降解的一種途徑，對維持體內環境穩定十分重要，大量研究顯示自噬作用與腫瘤發生發展存在密切聯系[7]。但槲皮素對肺部腫瘤的作用研究較少，因此本研究初步探討槲皮素對肺癌A549細胞自噬的影響以及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 人肺癌細胞系A549細胞購自中國科學院細胞庫。

1.1.2藥物 槲皮素購自美國Sigma公司(純度≥98%)，用0.05 mol/L的NaOH溶液配制成1 mmol/L槲皮素母液，過濾除菌后保存備用，使用前用含10% FBS的RPMI1640培養液稀釋至所需濃度。

1.1.3試劑 RPMI1640培養基、10%胎牛血清、胰酶購自Thermo Hyclone公司；CCK-8相關試劑購于美國Sigma公司；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒購自北京全式金生物公司；鼠抗人LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、beclin-1、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p-S6K、S6K、GAPDH一抗購及二抗(辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG)購自美國Santa Cruz公司；單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin，MDC)染色試劑盒購自金克隆(北京)生物技術有限公司；其他試劑購自國藥集團，均為分析純。

1.2方法

1.2.1細胞培養 取出凍存A549細胞系快速解凍后，添加PBS洗滌，置于離心機內3 000 r/min離心10 min 棄上清，添加含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養基4 ml，置于37℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞融合至80%時，去上清，PBS洗滌細胞，0.2%胰酶消化后加入培養基傳代培養，3代后進行計數。

1.2.2實驗分組 取對數生長期A549細胞，用培養基調整細胞濃度為1×104個/ml接種于96孔培養板，100 μl/孔，37℃、5%CO2條件培養。次日進行分組，分為空白對照組：含10% FBS的RPMI1640培養液；槲皮素組：低、中、高劑量組分別加入終濃度為100、150、200 μmol/L槲皮素溶液。

1.2.3CCK-8法檢測槲皮素對A549增殖的影響 取1.2.2中各組細胞分別培養24 h、48 h、72 h，每組設6個復孔，加入10 μl CCK-8溶液，培養4 h后用酶聯免疫檢測儀測定各孔吸光值，并計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[1-(A藥物處理組-A空白孔)/(A未處理組-A空白孔)]×100%。

1.2.4MDC染色法檢測槲皮素對A549細胞自噬的影響 取1.2.2中各組細胞，培養48 h后按照MDC染色試劑盒操作說明進行染色，熒光顯微鏡下觀察(激發濾光片波長355 nm，阻斷濾光片波長512 nm)，計數并拍照。檢測到高亮點狀熒光代表自噬泡。

1.2.5Western blot檢測自噬及AMPK/mTOR通路相關蛋白表達 取1.2.2中各組細胞，培養48 h后加入細胞裂解液裂解細胞，蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測定細胞總蛋白濃度，經電泳、轉模、封閉后，添加(1∶500)鼠抗人LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、beclin-1、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p-S6K、S6K一抗，以GAPDH為內參，4℃過夜后，添加二抗稀釋液孵育2 h，ECL顯色后，于凝膠成像儀中觀察蛋白表達并保存圖像。

1.2.6AMPK抑制劑對自噬的影響 收集1.2.1中細胞，加入10 μmol/L AMPK抑制劑Compound C預孵育2 h后，加入200 μmol/L槲皮素。根據1.2.4中方法檢測細胞自噬形態變化，根據1.2.5中方法檢測LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、beclin-1蛋白及通路AMPK/mTOR相關蛋白表達水平。

2 結果

2.1不同濃度槲皮素對A549細胞增殖抑制影響 CCK8檢測顯示，與空白對照組比較，檢測濃度范圍內隨著槲皮素濃度的增加(100、150、200 μmol/L)，對A549細胞增殖抑制率顯著升高，呈濃度依賴關系(P<0.05)。與作用24 h相比，作用48、72 h細胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，作用48 h與72 h細胞增殖抑制率差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 槲皮素對A549細胞增殖抑制的影響Tab.1 Effect of quercetin on proliferation inhibition of A549

2.2不同濃度槲皮素對A549細胞自噬的影響 MDC染色顯示，空白對照組中僅有A549少量細胞檢測到高亮點狀熒光，槲皮素作用48 h后，槲皮素組A549細胞中各劑量組檢測到高亮點狀熒光的自噬泡數量依次增多。見圖1。

圖1 不同濃度槲皮素對A549自噬的影響(×400)Fig.1 Effects of quercetin at different concentrations on autophagy of A549 (×400)Note:A.Blank control group;B.Quercetin low dose group;C.Quercetin medium dose group;D.Quercetin high dose group.

2.3不同濃度槲皮素對A549細胞中自噬相關蛋白表達影響 作用48 h后，與空白對照組相比，槲皮素組各劑量A549細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、beclin-1表達依次升高(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 不同濃度槲皮素對A549細胞中自噬相關蛋白表達影響Tab.2 Effects of quercetin at different concentrations on expressions of autophagy-related proteins in A549

圖2 不同濃度槲皮素對A549細胞中自噬相關蛋白表達影響Fig.2 Effects of quercetin at different concentrations on expressions of autophagy-related proteins in A549 cellsNote:1.Blank control group;2.Quercetin low dose group;3.Quercetin medium dose group;4.Quercetin high dose group.

2.4不同濃度槲皮素對A549細胞中AMPK/mTOR通路相關蛋白表達影響 與空白對照組相比，槲皮素組各劑量A549細胞中p-AMPK/AMPK水平依次增加(P<0.05)，p-mTOR/mTOR、p-S6K/S6K蛋白表達依次降低(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 不同濃度槲皮素對A549細胞中AMPK/mTOR通路相關蛋白表達影響Tab.3 Effects of quercetin at different concentrations on expressions of AMPK/mTOR pathway related proteins in A549

圖3 不同濃度槲皮素對A549細胞中AMPK/mTOR通路相關蛋白表達影響Fig.3 Effects of quercetin at different concentrations on expression of AMPK/mTOR pathway-related proteins in A549 cellsNote:1.Blank control group;2.Quercetin low dose group;3.Quercetin medium dose group;4.Quercetin high dose group.

2.5AMPK抑制劑對A549細胞自噬及相關蛋白表達的影響

2.5.1AMPK抑制劑對A549細胞自噬的影響 細胞形態學檢測顯示，與槲皮素組相比，槲皮素+AMPK抑制劑組A549細胞中高亮點狀熒光的自噬泡數量減少。見圖4。

圖4 AMPK抑制劑對細胞自噬影響(×400)Fig.4 Effects of AMPK inhibitors on autophagy (×400)Note:A.Blank control group;B.Quercetin low dose group;C.Quercetin medium dose group;D.Quercetin high dose group.

2.5.2AMPK抑制劑對自噬相關蛋白及AMPK/mTOR通路相關蛋白影響 與槲皮素組相比， 槲皮素+AMPK抑制劑組p-AMPK/AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、beclin-1蛋白表達降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR、p-S6K/S6K表達升高(P<0.05)。見圖5、表4。

表4 AMPK抑制劑對自噬相關蛋白及AMPK/mTOR通路相關蛋白影響Tab.4 Effects of AMPK inhibitors on autophagy-related proteins and AMPK/mTOR pathway-related

圖5 AMPK抑制劑對自噬相關蛋白及AMPK/mTOR通路相關蛋白影響Fig.5 Effects of AMPK inhibitors on autophagy-related proteins and AMPK/mTOR pathway-related proteinsNote:1.Blank control group;2.Quercetin low dose group;3.Quercetin medium dose group;4.Quercetin high dose group.

3 討論

槲皮素是常見的黃酮類物質，廣泛存在于植物花、莖、葉、果實中，多以甙的形式存在，化學分子式為C15H10O7，在止咳、平喘、降壓等方面具有重要作用[8]。近年研究發現，其具有阻滯細胞周期、抑制腫瘤細胞傳導、誘導腫瘤細胞凋亡等作用，并對乳腺癌、結腸癌有較好的抑制作用[9,10]。本研究顯示經槲皮素處理肺癌A549細胞后，細胞增殖抑制率顯著升高，且呈劑量依賴性，提示槲皮素可抑制A549細胞增殖。

研究顯示，槲皮素可誘導胃癌細胞自噬產生抗腫瘤作用，其與肺癌的發生發展密切相關[11，12]。自噬是吞噬自身蛋白質進入囊泡并依賴溶酶體降解包裹內容物的過程，在機體正常生理及病理過程中均有顯示[12]。抗腫瘤藥物常通過誘導腫瘤細胞凋亡或自噬發揮治療作用[13]。Du等[14]研究表明，槲皮素通過誘導胃癌細胞自噬發揮抗腫瘤作用。本研究發現，槲皮素組A549細胞中檢測到高亮點狀熒光的自噬泡數量隨濃度升高而增多，提示槲皮素可促進A549細胞自噬。LC3是自噬過程中標志蛋白，外源物質刺激細胞自噬啟動時，胞漿型的LC3Ⅰ分解掉一小段多肽，轉化為LC3Ⅱ，參與自噬體膜形成[15]。beclin-1是形成自噬體的必要分子，可介導自噬相關蛋白定位于吞噬泡，并調控自噬體的形成[16]。本研究發現，槲皮素處理后，A549細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達以及beclin-1水平明顯上調，提示槲皮素可促進A549細胞中有自噬體膜及吞噬泡形成。

AMPK-mTOR通路在多種疾病中發揮作用。Long等[17]研究表明，AMPK-mTOR通路與細胞自噬相關。細胞接受外界刺激時，AMP/ATP水平升高，使AMPK活化，增強對AMPK下游mTOR蛋白功能的抑制作用，而mTOR是自噬發生發展的中心蛋白，可調節下游底物S6K磷酸化，抑制細胞自噬[18,19]。肖潔等[20]研究表明，槲皮素通過激活該通路誘導急性髓系白血病HL-60細胞自噬。因此本研究對AMPK-mTOR通路相關蛋白進行研究，結果發現，經槲皮素處理后，A549細胞中AMPK蛋白磷酸化水平劑量依賴性增加，mTOR蛋白磷酸化水平劑量依賴性降低，S6K蛋白磷酸化水平降低，提示槲皮素可能促進AMPK-mTOR通路活化。進一步研究顯示，添加AMPK特異性抑制劑Compound C后，A549細胞中高亮點狀熒光的自噬泡減少，同時細胞中AMPK蛋白磷酸化水平降低，下游mTOR、S6K磷酸化水平升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及beclin-1蛋白表達減少，提示槲皮素可能通過促進AMPK-mTOR信號通路的激活，促進A549細胞自噬發生。

綜上所述，槲皮素可能通過激活AMPK-mTOR通路，促進人肺癌細胞株A549細胞自噬，本研究為槲皮素治療肺癌提供一定理論基礎。但本研究也存在一定不足，何種自噬基因啟動誘發自噬有待深入探討。