姜黃素對膿毒癥急性肺損傷大鼠的保護作用

段金旗 林 艷

(張家口學院醫學院，張家口 075000)

目前，膿毒癥發病率、病死率居高不下，臨床救治十分困難，是當今重癥醫學所面臨的難題[1]。姜黃素具有抗腫瘤、清除自由基、抗氧化、抗炎等藥理作用，在多種疾病的治療方面有廣闊的應用前景[2]。許多文獻報道姜黃素對膿毒癥引起的器官損傷有保護作用，但對于膿毒癥引發的急性肺損傷(acute lung injury，ALI)療效，目前研究甚少[3]。本研究采用盲腸結扎穿刺(CLP)建立膿毒癥ALI大鼠模型，觀察大鼠肺組織病理變化，進一步研究姜黃素對膿毒癥ALI中炎癥因子的表達及相關作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒(武漢博士德公司)；HMGB1抗體(Santa Cruze公司)；RNA 提取試劑(美國 Gibco公司);SYBR Green PCR 試劑盒(TaKaRa 公司)；HMGB1引物合成(中國北京鼎國生物技術公司)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物工程有限公司)；姜黃素和二甲基亞砜(DMSO)(美國 Sigma公司)；Real-time PCR檢測儀ABI7900(美國 Applied Biosystems公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組與給藥 清潔級，雄性，6～8周齡SD 大鼠，體質量180～200 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(湘) 2015-0013，術前適應性喂養1周。 大鼠隨機分為 3 組(每組10 只)：對照組、模型組及治療組。對照組大鼠在麻醉開腹后立即關閉腹腔，術后不給藥。而模型組和治療組均依照文獻[4]采用CLP法建立膿毒癥ALI模型。治療組術后 2 h 經腹腔注射200 mg/kg的姜黃素(0.1% DMSO溶解)，模型組術后 2 h 經腹腔注射0.1 % DMSO (1 ml/kg)。

1.2.2標本處理 建模后，將大鼠麻醉腹主動脈采血4 ml ，分離血清，-80℃保存；對肺組織進行灌洗，收集灌洗液，-20℃保存；手術切取右肺葉于液氮中保存。

1.2.3檢測指標

1.2.3.1觀察大鼠生存率 以各組大鼠造模時間為起始點，觀察大鼠存活情況，以天為時間節點，共觀察7 d。

1.2.3.2HE染色觀察肺組織病理變化 將切除的右肺上葉組織固定于4%多聚甲醛中24 h，乙醇逐級脫水，石蠟包埋，連續切片，制備5 μm石蠟切片。脫蠟后，HE染色，于光學顯微鏡200倍視野下觀察組織病理學變化，并采集圖像。

1.2.3.3電鏡觀察肺組織超微結構變化 取右肺上葉組織，2.5%戊二醛預固定后，梯度乙醇脫水，無水丙酮/包埋劑滲透，包埋、超薄切片，采用電子透射電鏡觀察并對比各組血管內皮細胞、肺泡上皮細胞等超微結構變化。

1.2.3.4ELISA法檢測血清和BALF中TNF-α、IL-6含量 大鼠腹腔麻醉后，腹主動脈取血，分離血清，備用。并取左肺用預冷的生理鹽水進行支氣管肺泡灌洗，共3次，收集BALF，于4℃離心收集上清液。測定BALF及血清中TNF-α、IL-6水平。具體方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.3.5qRT-PCR法檢測肺組織HMGB1 mRNA表達 取肺臟組織，TRIzol法提取總RNA，按反轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，HMGB1、GAPDH引物序列由北京鼎國生物技術公司合成，再以反轉錄出來的cDNA為模板配成20 μl反應體系，在Real-time PCR儀上設定擴增參數，檢測樣品中HMGB1和GAPDH內參基因Ct值，重復3次，表達量用2-ΔΔCt法計算。

1.2.3.6Western blot檢測肺組織HMGB1蛋白表達 在液氮中將肺組織充分研磨，采用蛋白裂解液(RIPA)裂解，均漿后使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。配平各組蛋白濃度后，加熱變性，進行電泳分離、轉膜、脫脂牛奶封閉30 min，加入HMGB1抗體4℃過夜，加二抗室溫孵育2 h，ECL顯影。以HMGB1與β-actin的灰度值比值作為HMGB1蛋白表達量。

2 結果

2.1大鼠生存率 如圖1所示，治療組7 d生存率高于模型組(P<0.05)。

圖1 各組大鼠存活率比較Fig.1 Survival rate comparison of each group of ratsNote:*.P<0.05.

2.2HE染色觀察大鼠肺組織病理變化 對照組未見病理改變；模型組水腫明顯，肺泡及間質出現炎癥、出血，肺損傷逐漸加重，48 h后損傷到達高峰；治療組24 h后損傷到達高峰，48 h時肺損傷程度明顯減輕，見圖2。

圖2 各組肺組織病理變化(×200)Fig.2 Pathological changes of lung tissue in each group(×200)

2.3電鏡觀察各組大鼠肺組織超微結構變化 對照組肺泡毛細血管膜及肺泡上皮形態、數量基本正常，細胞連接緊密；模型組在6、12 h時肺泡上皮細胞數量下降，細胞器減少，連接顯疏松，在24、48 h時肺泡毛細血管內皮脫落，胞漿出現渾濁，細胞連接疏松；治療組在各時間點受損程度均較模型組輕，見圖3。

圖3 各組肺組織超微結構變化Fig.3 Ultra-structural changes of lung tissue in each groupNote:Length of scale=1 μm.

2.4qRT-PCR檢測各組大鼠肺組織HMGB1 mRNA表達 對照組大鼠各時間點肺組織HMGB1 mRNA表達明顯低于模型組或治療組(P<0.05)；與模型組相比，治療組在12、24、48 h時HMGB1 mRNA表達明顯下降(P<0.05)，見圖4。

圖4 不同時間各組大鼠肺組織HMGB1 mRNA表達Fig.4 Expression of HMGB1 mRNA in lung tissue of rats at different timeNote:Compared with control group,*.P<0.05;compared with model group,#.P<0.05.

2.5Western blot檢測各組大鼠肺組織HMGB1蛋白表達 對照組大鼠各時間點肺組織HMGB1 蛋白表達差異無統計學意義，且低于模型組或治療組；與模型組相比，治療組各時間點HMGB1蛋白表達明顯下降(P<0.05)，見圖5。

圖5 大鼠肺組織HMGB1蛋白表達Fig.5 Expression of HMGB1 in rat lung tissueNote:1.Control group;2.Model group 6 h;3.Model group 12 h;4.Model group 24 h;5.Model group 48 h;6.Treatment group 6 h;7.Treatment group 12 h;8.Treatment group 24 h;9.Treatment group 48 h.

2.6ELISA法檢測大鼠血清及BALF中TNF-α和IL-6含量變化 大鼠血清及BALF中TNF-α和IL-6含量變化情況相似。在不同時間點，對照組TNF-α和IL-6含量變化差異無統計學意義(P>0.05)，但明顯低于模型組或治療組；與模型組相比，治療組大鼠在24、48 h時血清和BALF中TNF-α和IL-6含量明顯下降(P<0.05)，見圖6。

圖6 大鼠血清及BALF中TNF-α、IL-6含量變化Fig.6 Changes of TNF-α and IL-6 in serum and BALF of ratsNote:Compared with control group,*.P<0.05;compared with model group,#.P<0.05.

3 討論

膿毒癥最新定義為宿主對感染引起失控反應導致危及生命的器官功能障礙綜合征，具有30%～70%的病死率，是重癥患者死亡的重要原因之一[5-7]。姜黃素是姜科植物根莖中提取的天然黃色多酚類化合物，其結構為雙阿魏酰甲烷，因其提取工藝簡單、安全、廉價，且具有抗腫瘤、抗淀粉樣蛋白、抗菌、抗氧化、抗炎等作用，而逐漸成為醫學界的一個研究熱點[8]。文獻報道，姜黃素對細菌或注入內毒素引發的膿毒癥動物模型組織器官具有保護作用[9]。膿毒癥是引發ALI最重要的危險因素之一，目前還缺乏有效治療手段，而有關姜黃素對膿毒癥ALI方面的報道更少。CLP法建立膿毒癥ALI模型是目前公認與臨床相關性較高的建模方法，本研究采用此模型探索姜黃素對膿毒癥ALI中炎癥因子的調節作用機制。

大鼠生存率結果顯示，治療組7 d生存率高于模型組，說明姜黃素能改善大鼠7 d生存率。生存率研究還發現，模型組在48 h時死亡率為40%明顯高于治療組，這提示及早干預治療膿毒癥性ALI對提高生存率有重要作用；HE染色結果顯示，對照組未見病理改變，模型組水腫明顯，肺損傷隨時間延長逐漸加重，而治療組各時間點損傷程度較模型組減輕，說明姜黃素能減輕肺損傷炎癥程度，這一結論在電鏡觀察結果中也得到證實。

TNF-α主要由激活的淋巴細胞、單核/巨噬細胞等分泌，它能直接介導腫瘤細胞的凋亡和壞死，促進微血栓形成，誘導其他細胞因子如IL-1、IL-6等的產生[10]。IL-6 是一種多功能的細胞因子，能刺激造血干細胞的生長和增加急性相蛋白的合成，還能激活 T、B 淋巴細胞的免疫反應而調節機體免疫[11]。還有許多文獻報道，IL-6具有抑制炎癥反應的作用，是 TNF-α和 IL-1β的反調控/抗炎因子[12]。ELISA檢測結果顯示，在不同時間點，對照組中TNF-α、IL-6含量變化無統計學意義(P>0.05)，而與模型組相比，治療組在24、48 h時大鼠血清和BALF中TNF-α、IL-6含量明顯下降(P<0.05)，說明經姜黃素治療后能降低肺組織炎癥浸潤程度，血清和BALF中TNF-α、IL-6水平較模型組降低，有利于防止過度炎癥造成的肺損傷，提示姜黃素對膿毒癥ALI大鼠具有保護作用。

HMGB1是一種非組蛋白染色質結合蛋白，參與DNA的轉錄、復制、修復以及炎癥反應等[13]。以往研究證實HMGB1 能直接導致ALI，表現為炎癥細胞因子釋放增加、損傷肺實質細胞、肺泡充血和肺出血等[14]。TLR4能特異性地識別病原相關分子模式，激活核轉錄因子NF-κB，介導炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL6等表達，引起相應炎癥介質合成和釋放[15]。近年來大量研究結果還證實，HMGB1是TLR4的重要的內源性配體，如果抑制TLR4的功能，不僅有利于膿毒癥ALI抗炎作用，還能發揮抗膿毒癥作用，提示TLR4參與了膿毒癥ALI發病過程，干預TLR4可能會成為治療膿毒癥的新途徑[16]。研究中qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，模型組在各時間點HMGB1 mRNA和蛋白表達明顯上升，經姜黃素治療后HMGB1 mRNA和蛋白表達下降，說明HMGB1可能在不同水平參與膿毒癥ALI的發展，而姜黃素能夠抑制HMGB1的表達，可能下調TLR4進而降低肺部TNF-α、IL-6表達。

綜上所述，姜黃素可以在膿毒癥ALI大鼠中發揮治療作用，但實驗仍存在幾個問題：首先，膿毒癥ALI大鼠模型不能完全反映人類膿毒癥ALI發病；其次，本研究評估了姜黃素對模型組大鼠存活率的短期影響，而不是長期效果。因此還需要進一步長期研究姜黃素對膿毒癥ALI的保護作用。