異槲皮苷改善胰島素抵抗作用機制網絡藥理學分析

張傳藝，黃桂紅

【摘要】目的：基于網絡藥理學方法探討異槲皮苷改善胰島素抵抗相關靶點之間的相互作用及其作用機制。 方法：通過TTD（Therapeutic Target Database）、swiss Target Prediction以及PubChem數據庫找出異槲皮苷單成分基因靶點，再通過DisGeNET、Genecards、OMIM數據庫設置篩選條件，優選分數及相關性高的胰島素抵抗疾病靶點進行匯總，利用Venny軟件找到異槲皮苷與胰島素抵抗的共同靶點;利用STRING、DAVID、KEGG數據庫進行PPI蛋白網絡互做分析及富集（GO）分析和KEGG pathway分析;通過Cytoscape軟件構建異槲皮苷改善胰島素抵抗的“單成分-靶點-通路-疾病”的網絡模型。結果：檢索異槲皮苷基因靶點114個，檢索胰島素抵抗疾病靶點經篩選獲取563個，異槲皮苷和胰島素抵抗的共同靶點24個，其中核心靶點18個，預測核心靶點INSR、PI3K、AKT2、GSK-3為關鍵靶基因在 PI3K -Akt、mTOR、胰島素抵抗、糖尿病心肌病等信號通路上參與糖異生途徑、糖代謝、脂質代謝、抗炎等生物過程來發揮改善胰島素抵抗的作用[1]。結論：異槲皮苷通過多靶點、多通路構建“單成分-靶點-通路”的機制改善胰島素抵抗的發生與發展，為未來研究異槲皮苷影響關鍵靶基因在信號通路上mRNA和蛋白表達作用奠定基礎。

【關鍵詞】網絡藥理學 異槲皮苷 胰島素抵抗 作用機制

【中圖分類號】R587.1 【文獻標識碼】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2020.

異槲皮苷（isoquercitrin， IQ）又名羅布麻甲素 ，屬于黃酮醇類化合物，廣泛存在于砂仁、桑葉、羅布麻等多種藥用植物當中 ，也可人工合成。異槲皮苷作為藥用植物的有效成分具有許多藥理作用，如抗炎、抗腫瘤、降血壓、降血脂等[2]。異槲皮苷具有較大的藥用價值和應用前景，值得深入開發研究。單一成分的化學藥物可能特異性地作用于受體蛋白、生物膜通道、跨膜信號轉導蛋白等多個不同類型的靶點。中藥的復雜體系，使中藥小分子與靶點之間的聯系更加復雜。 網絡藥理學能從基因、分子水平去分析多種藥物分子作用于不同靶點、細胞和器官的生物學行為，能系統地預測和揭示不同藥物分子的作用及機制，幫助人們分析藥物對疾病網絡的干預與影響，更全面地了解藥物治療作用與疾病病理基礎。[3]

現已有部分關于異槲皮苷通過影響某些信號通路上的基因靶點而改善某些疾病的報道，如異槲皮苷可抑制ERK激酶（MEK）/細胞外調節蛋白激酶（ERK）信號通路促進核因子E2相關因子1（Nrf1）表達，實現對糖尿病腎病（DN）腎臟纖維化的修復[4]。又如異槲皮苷有誘導Hep G2細胞凋亡的作用，其作用機制可能與對Raf/MEK/ERK信號通路中相關因子的干預有關[5]。一方面，本研究可以運用網絡藥理學提前構建出這些基因靶點的理論模型，為實驗驗證節約時間;另一方面，為未來更深入研究異槲皮苷可激活胰島素抵抗等疾病相關信號通路上關鍵靶基因的mRNA和蛋白表達等作用延展實驗提供一定的理論依據[6]。

1 材料與方法

1.1材料

TTD數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、Swiss Target Prediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、DisGeNET數據庫（https：//www.disgenet. org/）、Genecards數據庫 （https：//www.genecards.org/）、OMIM數據庫（https：//omim. org）、Venny作圖軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）、STRING數據庫（https：//string-db.org/）、DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）、KEGG數據庫（https：//www.kegg.jp/kegg/kegg3a.html）、 Cytoscape作圖軟件。

1.2方法

1.2.1異槲皮苷靶點的篩選

利用TTD數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、Swiss Target Prediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）以及 PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）找到異槲皮苷的基因靶點并進行匯總。

1.2.2胰島素抵抗靶基因的篩選

利用DisGeNET數據庫（https：//www.disgenet.org/）、Genecards數據庫 （https：//www.genecards.org/）、OMIM數據庫（https：//omim.org）輸入關鍵詞“insulin resistance”查找胰島素抵抗發病基因，分別下載，其中篩選條件設置為：DisGeNET數據庫（https：//www.disgenet.org/）優選胰島素抵抗分數≥0.1，Genecards數據庫 （https：//www.genecards.org/）優選胰島素抵抗相關性≥20，最后將三個數據庫中的所有基因整理匯總，作為胰島素抵抗的疾病靶基因。

1.2.3成分-靶標網絡的構建

利用Venny作圖軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），針對異槲皮苷有效靶點和胰島素抵抗靶基因取交集，找到異槲皮苷和胰島素抵抗的共有基因靶點，得到相應名稱和個數。

1.2.4 PPI蛋白網絡互做分析（Protein-Protein Interaction，PPI）

利用STRING數據庫（https：//string- db.org/），在“Multiple proteins”一欄輸入共同靶點基因名稱，選擇人源基因（Homo sapines），得到PPI蛋白網絡互做圖，同時設置最低要求互動分數條件為 0.900及以上，得到PPI蛋白網絡互做分析圖，找出關鍵基因，再作圖進一步分析。

1.2.5富集（GO）分析和KEGG分析

利用DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/），選擇“start Analysis”，在step1中輸入異槲皮苷和胰島素抵抗關鍵靶點，接著在step2中的“選擇鑒別”一欄中選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，同時在step2a中設置篩選條件中種屬選擇智人（homo sapiens），在step3中選擇基因列表。在“Functional Annotation Tool ”功能注釋中僅勾選“Gene_Ontology ”中的“GOTERM_BP_DIRECT”、“GOTERM_CC_DIRECT”和“GOTERM_MF_DIRECT”以及“Pathways”中的“KEGG_PATHWAY”得到可視化表格并進行下載。

利用KEGG數據庫（https：//www.kegg.jp/kegg/kegg3a.html），在“KEGG mapping” 里找到“KEGG mapper”，點開進入，找到“Search&Color Pathway （and Brite， Module）”，輸入關鍵靶點，篩選條件是種屬為人，即選擇“homo sapience pathway”。選擇靶點數量較多出現在通路圖上的進行分析，著重分析與胰島素抵抗相關的通路和通路上的靶點。

1.2.6 藥物-靶點-通路-疾病Cytoscape作圖可視化分析利用Cytoscape作圖軟件繪制異槲皮苷和胰島素抵抗“單成分藥物-靶點-通路-疾病”的網絡關系驗證異槲皮苷改善胰島素抵抗的作用機制。

2 結果

2.1異槲皮苷單成分靶點

通過TTD數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、Swiss Target Prediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）以及 PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）找到異槲皮苷的基因靶點進行匯總，其中TTD數據庫在“target”結果中搜索出2個靶基因，分別為“AKR1B1、ACE”;Swiss Target Prediction數據庫畫出異槲皮苷分子式圖，如圖1，搜索出“target”對應的基因名稱“common name”下載;PubChem數據庫搜索結果見“BioAssay Results’中的“target name”，篩選“active”基因，共計114個。

2.2胰島素抵抗疾病靶點

通過DisGeNET數據庫（https：//www.disgenet.org/）、Genecards數據庫 （https：//www.genecards.org/）、OMIM數據庫（https：//omim.org）輸入關鍵詞“insulin resistance”查找胰島素抵抗發病基因，分別下載，其中篩選條件設置為：DisGeNET數據庫（https：//www.disgenet.org/）優選胰島素抵抗分數≥0.1;Genecards數據庫 （https：//www.genecards.org/）優選胰島素抵抗相關性≥20;OMIM數據庫（https：//omim.org）整理首基因。最后將三個數據庫中的所有基因刪除重復項，整理匯總，作為胰島素抵抗的疾病靶基因，共計563個。

2.3異槲皮苷與胰島素抵抗共同靶點

通過Venny作圖軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），針對異槲皮苷有效靶點和胰島素抵抗靶基因取交集，找到異槲皮苷和胰島素抵抗的共有基因靶點，共計24個，將所有共同基因名稱整理匯總，如圖2。

2.4 PPI蛋白網絡互做分析（Protein-Protein Interaction，PPI）結果

利用STRING數據庫（https：//string- db.org/），在“Multiple proteins”一欄輸入24個共同靶點基因名稱，選擇人源基因（Homo sapines），得到PPI蛋白網絡互做圖，同時設置最低要求互動分數條件為 0.900及以上，得到PPI蛋白網絡互做分析圖，找出連線緊密的核心基因18個，再將18個核心蛋白在“Multiple proteins”一欄輸入，繼續重復上述步驟，得到最終PPI蛋白網絡互做分析圖，如圖3，4。

2.5 富集（GO）分析和KEGG分析結果

利用DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）在“Start Analysis”頁面中首先在“Enter Gene List”一欄中輸入異槲皮苷和胰島素抵抗的核心基因靶點名稱，然后在“select Identifier”一欄中選擇“OFFICIAL-GENE-SYMBOL”;在“List Type”選擇“Gene List”;物種選擇人源，于是得到異槲皮苷和胰島素抵抗核心靶點的富集（GO）分析結果，其中生物學過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）的功能注釋依次根據數量降序排列，分別取前10項作圖分析，如圖5，6，7;信號通路（PATHWAY）按P值升序，取前10個做餅狀圖，并進一步分析，如圖8。接著利用KEGG數據庫（https：//www.kegg.jp/kegg/kegg3a.html）同樣輸入人源核心基因18個，首先驗證DAVID數據庫與KEGG數據庫搜索得出的關鍵靶點數量較多的信號通路的疾病名稱是否基本一致，再著重分析與胰島素抵抗相關的信號通路，在胰島素抵抗信號通路圖上，肝臟細胞的關鍵靶點有TNFα、IKKβ、INSR、PI3K、AKT2、GSK- 3，如圖10。

2.6異槲皮苷單成分-靶點-通路-疾病Cytoscape作圖可視化分析結果

通過Cytoscape作圖軟件繪制異槲皮苷和胰島素抵抗“單成分藥物-靶點-通路-疾病”的網絡關系驗證異槲皮苷改善胰島素抵抗的作用機制，其中通路篩選GO分析里“KEGG-pathway”中P值≤9.76E-10的信號通路，如圖11。

3結論

胰島素抵抗是細胞對胰島素的作用產生抵抗的一種狀態。胰島素抵抗普遍存在于多種代謝性疾病中，包括代謝綜合征（MS）、2型糖尿病、高血壓、血脂紊亂、心腦血管疾病[7]。通過網絡藥理學理論驗證出異槲皮苷改善胰島素抵抗的信號通路包括PI3K -Akt、mTOR、胰島素抵抗、糖尿病心肌病等[8]，其中胰島素抵抗信號通路尤為重要，在胰島素抵抗信號通路上顯示了多種作用機制：（a）通過絲氨酸/蘇氨酸激酶（如JNK1和IKKB）和蛋白激酶C增加IRS（胰島素受體底物）蛋白的磷酸化;（b）通過mTOR信號途徑增加IRS-1蛋白酶體的降解;（c）降低信號分子的活化包括PI3K和AKT[9-10];（d）磷酸酶（包括PTPs、PTEN和PP2A）活性的增加。另外，胰島素抵抗導致GLUT4易位減少，導致骨骼肌葡萄糖攝取和糖原合成增加，以及肝臟糖異生和糖原合成減少[11]。由胰島素抵抗信號通路得知異槲皮苷改善胰島素抵抗的主要途徑之一是通過激活肝臟PI3K/AKT信號通路改善胰島素抵抗，關鍵靶點包括INSR、PI3K、AKT2、GSK-3，可促進肝糖原的合成以及葡萄糖氧化分解，達到調節糖代謝、脂代謝紊亂的效果。而TNFα、IKKβ關鍵靶點可控制炎癥因子的分泌[12]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學對異槲皮苷改善胰島素抵抗的藥效成分、作用靶點及通路進行了分析，預測了異槲皮苷改善胰島素抵抗的基因靶點與作用通路，現有實驗表明異槲皮苷可以改善胰島素抵抗[13]。實驗結果顯示了異槲皮苷可以通過多靶點、多通路改善胰島素抵抗的特點，初步驗證的結果則表明了網絡藥理預測的可行性，為異槲皮苷改善胰島素抵抗的作用機制深入研究提供依據。

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作者簡介：

張傳藝（1996-），女，漢族，重慶，在讀碩士研究生，研究方向：藥學。

*通訊作者：

黃桂紅（1972-），女，藥學部主任，主任藥師，教授 ，碩士，碩士生導師，研究方向：抗糖尿病藥物研究。