姜黃素通過調控miR-21抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖促進細胞凋亡機制研究*

王貴年 禹亞杰 王佳妮

四川護理職業學院，四川省成都市 610100

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率較高，并且發病率逐年升高，嚴重影響女性的工作和生活，目前化療是乳腺癌患者術后輔助治療的主要手段，但易產生骨髓抑制、神經損傷等嚴重不良反應。姜黃素是從姜科植物姜黃等的根莖中提取得到的天然多酚類化合物,具有降血脂、抗氧化、抗菌消炎、免疫調節等多種藥理作用和生物學功能，可通過多種途徑抑制腫瘤生長[1]。據相關文獻報道，姜黃素可調控microRNA(miRNA)表達，從而發揮抗腫瘤作用[2-3]。本研究旨在明確miR-21在姜黃素抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖促進細胞凋亡機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人乳腺癌細胞株MCF-7購自中國科學院分子細胞科學卓越創新中心；胎牛血清、RPMI-1640培養液購自美國Gibco公司；DMEM細胞培養基(含100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素)、二甲基亞砜(DMSO)、MTT試劑購自美國Thermo Scientific HyClone公司;姜黃素(Sigma公司),用DMSO溶解,配制1mmol/L的儲備液；SYBR? Premix Ex TaqTM、miR-21引物均購于大連寶生物公司；Caspase-3活性檢測試劑盒(比色法)購自北京雷根生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養:MCF-7在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養液37℃,5%CO2細胞培養箱進行培養，取對數期的細胞，加入0.25%胰蛋白酶進行消化并傳代，用于實驗。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-21表達:經不同濃度(1、5、10、20、40μmol/L) 姜黃素24、48、72h作用MCF-7細胞，提取總RNA，使用SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒檢測miR-21表達水平，以U6 snRNA作為內參對照，PCR擴增條件：95℃10min，95℃變性10s，60℃退火55s ，60℃延伸 60s，45個循環，用△Ct=CtmiR-21-CtU6 snRNA法計算miR-21表達水平。

1.2.3 MTT 比色法檢測細胞增殖:取對數生長期MCF-7細胞，按照每孔5×103個細胞量加入細胞培養板中，設立實驗組和對照組，試驗孔中加入100μl不同濃度姜黃素(1、5、10、20、40μmol/L), 于37℃、5%CO2培養箱中培養24h， 37℃、5% CO2條件下培養24、48、72h；終止培養前6h，每孔加入5mg/ml MTT溶液(每孔10μl)后繼續培養，終止時棄去培養板孔內上清液，加入100μl DMSO, 用微孔振蕩器振蕩1min，酶標儀測定各孔A490nm值，計算細胞增殖抑制率[4]。

1.2.4 Transwell檢測細胞遷移:采用RPMI1640 培養液4∶1稀釋包被Transwell小室底部膜的上室， 37℃放置1h。取對數生長期的MCF-7細胞，胰酶消化細胞，PBS清洗2次，調整細胞密度為4×105/100μl。每個小室加入100μl細胞懸液，并加入不同濃度(1、5、10、20、40μmol/L)姜黃素，下室分別加入20%胎牛血清的DMEM培養基，37℃、5%CO2培養箱中培養培養48h，吸取上室的細胞懸浮液，用4%的多聚甲醛固定15min，用1%結晶紫染色20min，在光學顯微鏡下取 3～5個視野進行計數[5]。

1.2.5 Caspase-3活性檢測:取對數生長期MCF-7細胞，用不同濃度姜黃素(1、5、10、20、40μmol/L)處理48h后，用PBS洗滌細胞，0.25%胰蛋白酶消化、收集細胞，離心后棄去上清后制成細胞懸液，加入細胞裂解液，按照Caspase-3活性檢測試劑盒(比色法)操作說明步驟，酶標儀測定A405nm值，同時并繪制標準曲線，檢測各組MCF-7細胞的Caspase-3活性(pmol/min/μg)。

2 結果

2.1 姜黃素抑制miR-21表達 使用不同濃度姜黃素(1、5、10、20、40μmol/L)作用MCF-7細胞為實驗組，隨著姜黃素濃度升高，miR-21表達量逐漸降低，在10μmol/L、 20μmol/L和40μmol/L組，與1μmol/L、5μmol/L組比較，miR-21表達量明顯下降(P<0.01)， 見圖1。

圖1 不同濃度姜黃素對MCF-7細胞miR-21表達的影響

2.2 姜黃素抑制MCF-7細胞增殖 不同濃度的姜黃素(1、5、10、20、40μmol/L)作用于MCF-7細胞，與DMSO為對照組比較，實驗結果顯示，在24h、48h、72h后， 20μmol/L和40μmol/L組細胞增殖抑制率明顯升高，隨著姜黃素濃度的增加，作用時間越長，抑制作用越明顯，呈現出劑量及時間依賴性(P<0.01)，見圖2。

圖2 不同濃度姜黃素對MCF-7細胞增殖程度的影響

2.3 姜黃素抑制MCF-7細胞遷移 Transwell檢測細胞遷移能力，實驗結果顯示，不同濃度的姜黃素(1、5、10、20、40μmol/L)能夠降低MCF-7細胞的遷移能力，其48h的抑制率隨著姜黃素濃度增加，其抑制作用越強，并且呈現出劑量依賴性(P<0.01)，見圖3。

圖3 姜黃素對MCF-7細胞遷移的影響

2.4 姜黃素能夠促進MCF-7細胞凋亡 經過不同濃度姜黃素(1、5、10、20、40μmol/L)處理48h后的MCF-7細胞進行Caspase-3活性檢測。實驗結果顯示，與對照組相比，隨著姜黃素濃度的不斷增加，Caspase-3活性表達程度呈現出上升趨勢，表明姜黃素能夠促進MCF-7細胞凋亡(P<0.01)，見圖4。

圖4 姜黃素對MCF-7細胞凋亡的影響

3 討論

乳腺癌位居女性惡性腫瘤發病之首，發病率逐年增高趨勢[6]。乳腺癌主要使用手術、化學治療、內分泌等治療方式，但其復發性、轉移性等受多種因素的影響[7]。姜黃素是一種脂溶性多酚類化合物，主要存在于姜黃、郁金、莪術等的根莖中，具有抗感染、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用，對肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等產生抑制腫瘤細胞生長和誘導腫瘤細胞凋亡的作用[8]。

乳腺癌的發生與miRNA的異常表達有關，miRNAs在乳腺癌組織中異常表達并且參與調控細胞的凋亡和侵襲等過程[9]。miR-21是單個基因編碼miRNA, 編碼基因位于17q23.2。miR-21在多個實體瘤(乳腺癌、直腸癌、肺癌等)中的表達均上調，參與腫瘤細胞的增殖與轉移等有關[10-11]。近年來相關文獻報道，乳腺癌患者血清miR-21高表達，不僅與乳腺癌的發生有關，而且其表達上調可能會導致淋巴結轉移，miR-21可作為一個腫瘤轉移促進基因，在乳腺癌的轉移中發揮作用[12]。

細胞凋亡是基因控制的細胞自然死亡，Caspase與細胞凋亡有關的蛋白家族，其中Caspase-3位于細胞凋亡反應的下游；Caspase-3在正常情況下無活性，被激活后能夠發揮促進凋亡的作用[13]。據相關研究報道，Caspase-3是細胞凋亡的關鍵酶，與腫瘤的發生、侵襲、轉移等密切相關，姜黃素能促進腫瘤細胞中Caspase-3等相關凋亡因子活化，抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡[14]。

本實驗結果顯示，經姜黃素作用MCF-7細胞后，qRT-PCR檢測miR-21呈低表達水平；不同濃度的姜黃素均能抑制MCF-7細胞增殖并促進其凋亡；隨著姜黃素濃度遞增, MCF-7細胞miR-21的表達減少，Caspase-3活性表達增加，Caspase-3的表達增加呈劑量依賴性；提示姜黃素可能通過調控miR-21的表達并通過促進乳腺癌細胞凋亡，從而對乳腺癌的抑制作用。

綜上所述，姜黃素通過下調miR-21的表達，抑制乳腺癌細胞MCF-7細胞增殖，并促進其凋亡。本研究結果能夠為臨床應用姜黃素治療乳腺癌提供實驗理論依據。