新penA鑲嵌等位基因致淋病奈瑟菌頭孢菌素耐藥的分子機制*

向 波 向 輝 熊 文 劉龍亞 印道春 王永杰 向 敏 符自清

吉首大學第一附屬醫院(湘西土家族苗族自治州人民醫院) 1 檢驗科 2 腫瘤科 3 腎內科 4 泌尿一科 5 皮膚科 ，湖南省吉首市 416000

自20世紀40年代，青霉素廣泛用作治療淋病的一線藥物以來，科研工作者陸續發現對氨基糖苷類、β內酰胺類、四環素類、氟喹諾酮類和廣譜頭孢菌素類耐藥淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)[1]。更嚴重的是，NG泛耐藥(Extensively drug resistant, XDR)現象已經出現，2018年英國和澳大利分別發現了本國首例XDR的NG菌株[2-3]。伴隨耐藥現象的是每年全球上億例淋病的高發病率。我國醫療和疾病控制系統對NG檢測力度仍遠遠不及發達國家，盡管中國于1987年建立了淋球菌耐藥檢測系統(GASP)，但是絕大部分醫院沒有開展NG培養和藥敏試驗，因此國內淋病疫情可能只是“冰山一角”。國內僅江浙以及兩廣地區一些科研院所進行小范圍科研工作，報道了少量頭孢菌素低敏和阿奇霉素耐藥的NG菌株[4-5]。在抗生素選擇性壓力下，具有強大耐藥特質的NG必將出現頭孢菌素耐藥菌株，也將會給我國醫務工作者和衛生管理者帶來嚴峻挑戰。故加強監控淋病一線治療藥物頭孢曲松耐藥NG菌株流行狀況，進一步闡明NG對頭孢菌素耐藥機理是淋病防治工作的重點之一。本課題組前期研究發現1例頭孢菌素耐藥菌株wls18099，進一步檢測了與NG耐藥密切的penA、mtrR、penB和ponA基因相關信息[6-9]，進行了penA基因轉化試驗，并研究了其耐藥分子機理和分子流行病學特點。

1 資料與方法

1.1 耐藥菌株及藥敏實驗 2018年9月，我們從武陵山區1名48歲有雙性接觸史的男性淋病患者尿道膿液中分離出1株頭孢克肟和頭孢曲松耐藥菌株(wls18099)。該患者無出國經歷，口服200mg/bid頭孢克肟4周，治療失敗。治療期間無任何性接觸，但其性伴侶的性接觸史未知。之后，用單劑量160mg慶大霉素注射治療成功。1個月后，NG培養和NG-PCR復檢陰性。NG微生物學鑒定及藥敏實驗，參照第28版CLSI M100。

1.2 NG-MAST分型、耐藥基因擴增及生物信息學分析 使用上海生工試劑盒(貨號B518255)提取NG基因組DNA。分子流行病學分析采用NG-MAST分型，引物：por，CAAGAAGACCTCGGCAA和CCGACAACCACTTGGT；tbpB，CGTTGTCGGCAGCG-CGAAAAC和TTCATCGGTGCGCTCGCCTTG。擴增：95℃ 4min，95℃ 30s，por 58℃/tbpB 69℃各30s, 72℃ 1min,25個循環,72℃10min。penA、mtrR、penB和ponA 4種與NG密切相關的重要耐藥基因PCR引物參照Liao M和Lee SG的數據[10-11]。PCR擴增：引物0.5μl，模板0.5μl，酶0.5μl，鎂1.5mmol/L，dNTPs 200μmol/L；94℃4min，94℃40s，penA 58℃/mtrR 50℃/penB 46℃/ponA 56℃各40s，72℃50s，35個循環，最后72℃ 6min。擴增儀為ABI7500。電泳檢查產物，提取凝膠中DNA，送上海生工測序。使用BioEdit7.1.9比對這4種耐藥相關基因在wls18099和野生型菌株M32091之間的差異。

1.3 penA基因轉化分析 通過比對后，將wls18099菌株中存在差異的基因，進行轉化實驗[12]。受體菌株為兩種標準菌株WHO M(MIC頭孢克肟≤0.016μg/ml、MIC頭孢曲松0.016μg/ml)、WHO L(MIC頭孢克肟0.25μg/ml、MIC頭孢曲松0.125μg/ml)以及一種臨床分離頭孢菌素敏感菌株wls11020(MIC頭孢克肟0.008μg/ml、MIC頭孢曲松0.016μg/ml)。設立重復實驗，并測定轉化后WHO M’、WHO L’和wls11020’菌株中penA、ponA、mtrR和penB序列，以排除轉化引起新的變異。最后測定3種轉化株對頭孢克肟和頭孢曲松的最小抑菌濃度(MIC頭孢克肟和MIC頭孢曲松)。

2 結果

2.1 wls18099耐藥菌株分子生物學信息 wls18099耐藥菌株NG-MAST分型，屬于ST14155。該菌株mtrR、penB和ponA基因序列與野生型菌株M32091比對，未發現新突變。我們在該菌株penA基因中，發現一種類似penA ⅩⅩⅩⅣ基因型的新鑲嵌等位基因型。其包含bp1507A/C與1508A/C顛換，并導致青霉素結合蛋白氨基酸序列K503P錯義突變(賴氨酸→脯氨酸)，暫命名為penA wls ⅩⅩⅩⅣ/K503P，見圖1。

圖1 頭孢菌素耐藥wls18099菌株和頭孢曲松敏感野生型M32091菌株間penA基因編碼蛋白PBP2氨基酸序列差異

2.2 轉化實驗前后3種菌株MIC值變化及4種基因特點 wls18099菌株對頭孢克肟和頭孢曲松耐藥。WHO M、WHO L和wls11020轉化wls18099菌株penA基因后頭孢菌素類MIC值較轉化前上升4～62倍，詳見表1。WHO M、WHO L、wls11020和wls18099菌株por、tbpB、penA、ponA、mtrR和penB基因特點，詳見表2。轉化后WHO M’、WHO L’和wls11020’菌株除penA wls ⅩⅩⅩⅣ/K503P位點改變，其余3種基因序列未產生新的變異。

表1 3種菌株轉化penAwls ⅩⅩⅩⅣ/K503P等位基因前后MIC值

表2 WHOM、WHOL、wls11020和wls18099菌株基因特點

3 討論

wls18099是湖南省首例頭孢菌曲松耐藥淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)，我們采用多抗原序列分型(NG-MAST)，探討了其分子流行病學特征。wls18099菌株與日本兵庫縣發現的KG12051菌株NG-MAST分型分別為ST14155和ST14150型，por基因型分別為ST8178型和ST8173型，二者tbpB基因型均為ST110型。生物信息學比對發現，二者por基因堿基序列差異<100bp，二者同屬于G1407基因群，兩株菌同源性極高[13]。盡管該基因群NG是歐洲和亞洲流行的頭孢曲松耐藥NG之一，但是2015年中國首先報道的該群菌株對頭孢曲松均敏感(MIC 0.008～0.06μg/ml)[13-15]。從上述報道的時間先后可以推測出我們發現的頭孢曲松耐藥菌株wls18099來源于國外的G1407基因群。眾所周知，擁有強大的基因重組和潛在的高度耐藥變異能力是NG的重要特性。很明顯，該群NG通過近幾年在國內傳播，可能獲得了頭孢菌素類耐藥抗性的基因改變，導致其對頭孢菌素類敏感性由敏感轉化為耐藥。

NG對廣譜頭孢菌素(Extended spectrum cephalosporins，ESCs)產生耐藥主要與penA、mtrR、penB和ponA等基因突變相關。本課題組通過對wls18099耐藥株4種基因測序，發現penA基因出現一種特殊wls ⅩⅩⅩⅣ/K503P鑲嵌突變，未在其余3種基因中檢出新突變。2015年國內報道的4例G1407群NG菌株中，有3例頭孢曲松敏感菌株的penA基因型為ⅩⅩⅩⅣ型[15]。我們發現的頭孢曲松耐藥菌株wls18099與前述3例頭孢曲松敏感NG菌株差異在于，penA基因編碼蛋白PBP2發生了新的K503P改變。這提示我們，penA wls ⅩⅩⅩⅣ/K503P等位基因型可能是導致wls18099菌株與其他頭孢菌素敏感NG菌株在藥敏表型上差異的主要原因。我們在國內首次報道了這種新的penA鑲嵌等位基因，這也是本研究最重要的發現。

目前，已經先后發現49種penA等位基因型，其中Ⅹ、ⅩⅩⅥ、ⅩⅩⅦ和ⅩⅩⅩ等都屬于鑲嵌基因型[11,16]。penA鑲嵌等位基因型具有較高的復雜性和多變性，其中涉及突變位點達到50余個。上述已知類型的鑲嵌等位基因型與耐藥有一定聯系，但無嚴格對應關系[15]。因為，不同NG菌株耐藥表型的差異不僅僅是蛋白質一級序列的問題，還可能與編碼蛋白的基因組甲基化、基因誘導調控等表觀遺傳調控等協同因素相關。近年來，針對penA鑲嵌等位基因型的研究逐漸由Ⅹ轉向 ⅩⅩⅩⅣ型[7]。2018年Ryan L應用whole-genome sequencing技術，在9例頭孢菌素低敏菌株中檢測出6例含有penA ⅩⅩⅩⅣ等位基因[17]。2018年，Washington在美國佐治亞州1名23歲士兵的尿道拭子中檢出了頭孢克肟耐藥菌株G093攜帶penA ⅩⅩⅩⅣ鑲嵌型等位基因型[8]。科研工作者們先后在舊金山、臺灣和加拿大發現 ⅩⅩⅩⅣ型[18]，但是其對頭孢曲松和頭孢克肟僅僅表現為敏感性降低，MIC分別為0.06～0.125μg/ml和0.125～0.25μg/ml。本研究特殊之處在于，同樣包含penA ⅩⅩⅩⅣ基因型的wls18099具有更高水平的耐藥現象，頭孢曲松和頭孢克肟MIC分別為0.25μg/ml和1μg/ml。上述差異可能與wls18099菌株同時具有penA ⅩⅩⅩⅣ等位基因和一個未見報道的PBP2蛋白A503P氨基酸錯義突變有關。賴氨酸A與脯氨酸P結構和生理功能相差較大，我們據此假設，penA ⅩⅩⅩⅣ鑲嵌基因和PBP2蛋白A503P變異具有協同作用，共同導致wls18099菌株產生耐藥表型。

我們對penA wls ⅩⅩⅩⅣ/K503P鑲嵌型等位基因認識還遠遠不夠。因此，我們在頭孢菌素耐藥wls18099菌株與2種標準菌株和1種頭孢菌素敏感菌株間分別進行了penA基因水平轉化實驗，初步闡明了其對PBP2抗頭孢菌素類抗生素的活性。轉化實驗采用的受體菌株為WHO M、WHO L標準菌株以及臨床分離頭孢菌素敏感菌株wls11020。結果顯示，3種菌株轉化wls18099菌株penA wls ⅩⅩⅩⅣ/K503P鑲嵌型等位基因后，均顯示出對頭孢克肟和頭孢曲松耐藥特征，且MIC值是轉化前的4～62倍。通過對上述3種受體菌株中其他主要耐藥基因測序(ponA、mtrR和penB)，明確了penA基因轉化試驗沒有造成這3種基因序列產生新的變異，排除了這3種NG耐藥相關基因突變而引起耐藥性改變的干擾。這提示，wls18099耐藥菌株攜帶的penA ⅩⅩⅩⅣ/K503P鑲嵌基因型很可能是導致該菌株對頭孢菌素類抗生素穩定地產生耐藥性的重要獨立因素。

綜上所述，我們于2018年首次在國內分離出1例伴有K503P錯義突變的penA wls ⅩⅩⅩⅣ/K503P鑲嵌等位基因型的頭孢菌素類耐藥NG株wls18099。盡管penA ⅩⅩⅩⅣ鑲嵌基因型不是引起NG耐藥的唯一因素，但是本課題組通過penA基因轉化試驗證實，前者在PBP2蛋白K503P改變的協同下，產生穩定耐藥性。在后續研究中，我們將繼續監測penA wls ⅩⅩⅩⅣ/K503P等位基因型，在湖南和周邊省份的播散情況，以控制頭孢菌素耐藥的wls18099菌株播散。