液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定雞肉中甲基睪酮的不確定度評(píng)定

焦紹明，李卿沛，代春梅，徐尚喜

（金昌市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，甘肅 金昌 737100）

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1290-6460C型液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；IKA VXR渦旋振蕩器（艾卡公司）；Smart-N30VF超純水機(jī)（力康公司）；感量為0.01 g、0.1 mg的電子天平（德國賽多利斯公司）；1 000 μl移液器（德國普蘭德公司）；Agilent Bond Elut C18固相萃取柱（500mg/3 ml，Agilent公司）。

甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)品：50mg，Stanford Chemicals。乙腈、甲醇：色譜純，美國Fisher公司。試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取10 mg甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容至于100 ml容量瓶中，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取0.1 ml標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇定容至10 ml，配制成1mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，于-18℃冰箱中保存。

1.2.2 前處理方法 稱取2 g糜狀雞肉樣品于50 ml離心管，加入10 ml乙腈，渦旋振蕩5 min，超聲提取10 min，10 000 r/min離心10min，取上清液至雞心瓶，殘?jiān)貜?fù)提取一次，合并上清液于雞心瓶中，40℃負(fù)壓旋蒸至干，加入5ml 30%甲醇水溶液溶解殘余物，待凈化。

C18固相萃取柱預(yù)先用3ml甲醇、3ml水活化，上述待凈化溶液全部過柱，用2 ml30%甲醇水溶液淋洗小柱，抽干后使用3 ml90%甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液于40℃下氮?dú)獯蹈桑? ml 50%甲醇水溶液溶解殘?jiān)^0.22μm微孔有機(jī)濾膜后待檢測(cè)。

1.3 儀器條件

色譜柱為AgilentZORBAXSB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫為35℃；流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的超純水，B為含0.1%甲酸的乙腈；液相流速為0.25 ml/min；梯度洗脫為0 min 90%A，2 min 60%A，4 min 40%A，6 min 15%A，7 min 20%A，9 min 90%A。電噴霧正離子模式（ESI+）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；甲基睪酮離子對(duì)：303.2/109（定量）、303.2/97.1；傳輸電壓為119V。

家政服務(wù)員朱大哥說，實(shí)在沒活干才會(huì)選擇當(dāng)養(yǎng)老護(hù)理員，其工作缺點(diǎn)是收入偏低，護(hù)理老年人工作量還大，還要承擔(dān)風(fēng)險(xiǎn)，老年人一旦出現(xiàn)意外，這個(gè)責(zé)任他們擔(dān)不起。有些養(yǎng)老護(hù)理員和老人們有了感情，掙多掙少無所謂，可很多剛進(jìn)城的務(wù)工者離家打工就是為了掙錢，養(yǎng)老護(hù)理員并不是他們的首選。

1.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

取空白雞肉樣品按照前處理步驟制備基質(zhì)溶液，用基質(zhì)溶液將標(biāo)準(zhǔn)中間液逐級(jí)稀釋成濃度為200 μg/L、100 μg/L、50 μg/L、20 μg/L、10μg/L、5 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 建立數(shù)學(xué)模型

甲基睪酮含量計(jì)算公式：

式中：X為樣品中甲基睪酮的含量（μg/kg）；C為樣品中甲基睪酮濃度（μg/L）；V為樣品最終定容體積（ml）；m為樣品質(zhì)量（g）。

2 不確定度分量主要來源

2.1 配制標(biāo)液引入的不確定度

由標(biāo)準(zhǔn)品純度以及配制標(biāo)準(zhǔn)品使用的天平、移液管、容量瓶等的最大允許誤差引入。

2.2 樣品稱重引入的不確定度

由稱重天平的最大允許誤差引入。

2.3 最終定容體積引入不確定度

由最終定容體積使用移液器的最大允許誤差引入。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度

由最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)C引入。

2.5 實(shí)驗(yàn)回收率引入的不確定度

由前處理步驟對(duì)回收率的影響引入。

2.6 液質(zhì)聯(lián)用儀引入的不確定度

由儀器檢測(cè)過程引入。

3 測(cè)量不確定度的計(jì)算

3.1 配制液引入的不確定度

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書給出甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)品的純度為98.85%±1.0%，取矩形分布（k=3），引入不確定度為：

3.1.2 配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液引入的不確定度 根據(jù)檢定證書，感量0.000 1 g電子天平的最大允許誤差為±0.001 5g，取矩形分布（k=3），引入不確定度為：

根據(jù)檢定證書，100 ml容量瓶的最大允許誤差為±0.1 ml，取矩形分布（k=3），引入不確定度為：

3.1.3 配制標(biāo)準(zhǔn)中間液引入的不確定度 根據(jù)檢定證書，0.1 ml移液管的最大允許誤差為±0.004 ml，取矩形分布（k=3），引入不確定度為：

根據(jù)檢定證書，10 ml容量瓶的最大允許誤差為±0.02ml，取矩形分布（k=3），引入不確定度為：

3.1.4 配制標(biāo)液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.2 樣品稱重引入的不確定度

根據(jù)檢定證書，感量0.01g電子天平的最大允許誤差為±0.05g，取矩形分布（k=3），引入不確定度為：

3.3 最終定容體積引入的不確定度

根據(jù)檢定證書，1 000 μl可調(diào)式移液器的擴(kuò)展不確定度為0.5μl（k=2），引入不確定度為：

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度

配制5、10、20、50、100、200μg/L等6個(gè)濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別測(cè)試3次，測(cè)量結(jié)果用最小二乘法擬合得到線性回歸方程：y=303.38x-266.31（R2=0.9992），=64.167μg/L，峰面積測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差S為：

配置濃度為50μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)測(cè)定6次，峰面積結(jié)果見表1，測(cè)定樣品中甲基睪酮含量的平均值C0=50.79μg/L。

引入不確定度為：

3.5 試驗(yàn)回收率引入的不確定度

稱取2 g空白雞肉樣品，添加甲基睪酮標(biāo)液至20 μg/kg，做6個(gè)平行樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其含量和回收率，含量平均值=20.38μg/kg，回收率見表2。

引入不確定度為：

3.6 液質(zhì)聯(lián)用儀引入的不確定度

根據(jù)檢定證書，液質(zhì)聯(lián)用儀的不確定度為U=10%，k=2，引入不確定度為：

3.7 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度

3.7.1 各分量合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.7.2 擴(kuò)展不確定度

取包含因子k=2，在95%置信水平下，甲基睪酮擴(kuò)展不確定度為：

3.8 結(jié)果報(bào)告

4 結(jié)論

通過對(duì)不確定度引入各個(gè)分量的評(píng)定來看，液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定、標(biāo)液配制和回收率引入的不確定度較大，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)盡可能規(guī)范操作，以提高測(cè)量精確度。

表1 重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定結(jié)果峰面積

表2 雞肉中甲基睪酮加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果