食品中沙門氏菌的測定

練曉娟，宋勇強，仝偉建，楊曉楠，何建紅

（蘭州國信環(huán)境能源科技有限責任公司，甘肅 蘭州 730050）

沙門氏菌（Salmonella）是一類廣泛存在于自然界中的無芽孢、無莢膜、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌[1]。沙門氏菌的最適生長溫度為35～37℃，菌對外界環(huán)境有一定的抵抗力，在動物性食品中可存活數周至數月，在糞便中可存活數月，在鹽分為 5%～8%的環(huán)境下，也可存活超過30 d[2]。

沙門氏菌是一種常見的人畜共患的食源性致病菌，主要在人類和動物腸道中寄生。當沙門氏菌菌體溶解時，細胞壁能夠釋放出脂多糖，從而形成內毒素[3]。感染沙門氏菌可致慢性咽炎、腸熱癥、食物中毒等。據統計在世界各國的種類細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。每年超過3 000萬人感染沙門氏菌，引起20多萬人死亡[4]。沙門氏菌病是指由各種類型沙門氏菌所引起的對人類、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱。沙門氏菌分型較多，而且具有較高的致病性，為致病菌的一種[5-10]。感染沙門氏菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發(fā)生食物中毒。其中由傷寒、副傷寒沙門氏菌引起的急性全身系統性傳染病是我國《傳染病防治法》中規(guī)定報道的乙類傳染病[11]。目前全球已知的沙門氏菌屬，有的專對人類致病，有的只對動物致病，也有對人和動物都致病的。并且能夠在短時間內大量繁殖。傷寒、急性腸胃炎、菌血癥和敗血癥等疾病皆是由沙門氏菌感染所引起的[12]。因此，食品中沙門氏菌的檢測也成了食品安全檢測中至關重要的一項。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 蘭州市市售不同品牌的火腿腸11份，編號A～K。

1.1.2 標準菌株 陽性對照菌株-鼠傷寒沙門氏菌FSCC215013（ATCC14028）購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

1.1.3.1 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂：蛋白胨10.0 g/L、牛肉浸膏3.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L、瓊脂15.0 g/L，121℃滅菌15 min，購于北京路橋技術股份有限公司；

緩沖蛋白胨水（BPW）：蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L、磷酸氫二鈉（12H2O）9.0 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L，121℃滅菌15 min，購于北京路橋技術股份有限公司；

四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液基礎：蛋白胨9.0 g/L、牛肉粉4.5 g/L、氯化鈉2.7 g/L、碳酸鈣40.5 g/L、牛膽鹽5.0 g/L、硫代硫酸鈉（含5個結晶水）50.0 g/L，121℃滅菌20 min，購于北京路橋技術股份有限公司；

亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液：蛋白胨5.0 g/L、乳糖4.0 g/L、磷酸氫二納10.0 g/L、亞硒酸氫鈉4.0 g/L、L-胱氨酸0.01 g/L，加熱煮沸滅菌，購于北京路橋技術股份有限公司；

亞硫酸鉍（BS）瓊脂：蛋白胨10.0 g/L、亞硫酸鈉6.0 g/L、牛肉粉5.0 g/L、煌綠0.025 g/L、葡萄糖5.0 g/L、檸檬酸鉍銨2.0 g/L、磷酸氫二鈉4.0 g/L、瓊脂18.0 g/L、硫酸亞鐵0.3 g/L，加熱煮沸滅菌，購于北京路橋技術股份有限公司；

木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂：酵母膏3.0 g/L、酚紅0.08 g/L、L-賴氨酸5.0 g/L；硫代硫酸鈉6.8 g/L、木糖3.75 g/L、檸檬酸鐵銨0.8 g/L、乳糖7.5 g/L、去氧膽酸鈉2.5 g/L、蔗糖7.5 g/L、瓊脂15.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L，加熱煮沸滅菌，購于北京路橋技術股份有限公司；

三糖鐵（TSI）瓊脂：蛋白胨20.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L、葡萄糖1.0 g/L、蔗糖10.0 g/L、牛肉粉5.0 g/L、硫代硫酸鈉0.2 g/L、酚紅0.025 g/L、乳糖10.0 g/L、硫酸亞鐵銨（6H2O）0.2 g/L、瓊脂12.0 g/L，分裝后115℃滅菌15min，購于北京路橋技術股份有限公司。

1.1.3.2 試劑

氯化鈉，北京路橋技術股份有限公司；P-72碘液，北京路橋技術股份有限公司；P-73 0.1%煌綠，北京路橋技術股份有限公司；0.5%麥氏比濁液，北京路橋技術股份有限公司；沙門氏菌生化鑒定試劑盒，北京路橋技術股份有限公司。

1.1.4 儀器與設備 BSA822電子天平（百分之一），賽多利斯（上海）貿易有限公司；GR85DA高壓滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學有限公司；HR40-IIA2生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；HCB-1300V超凈工作臺，青島海爾特種電器有限公司；移液器，普蘭德（上海）貿易有限公司；FE28-Standard酸度計（pH計），瑞士梅特勒-托利多。

1.2 方法

1.2.1 方法選擇 依照國家標準《GB4789.4-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》提供的方法進行檢測。

1.2.2 樣品采集 隨機采購蘭州市市售不同品牌火腿腸11份。

1.2.3 預增菌 無菌操作稱取25 g樣品，置于盛有225 ml BPW的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1～2 min。用1 mol/ml無菌NaOH或HCL調pH至6.8±0.2，于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)8～18 h。

1.2.4 增菌 輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1 ml，轉種于10 ml TTB內，另取1 ml，轉種于10 ml SC內，同時于陽性對照間接種沙門氏菌標準菌株陽性對照，TTB增菌液于42 ℃±1℃培養(yǎng)18～24 h，增菌液于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.5 分離 分別用直徑3 mm的接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個BS平板和一個XLD平板，同時于陽性對照間接種沙門氏菌標準菌株陽性對照，BS瓊脂平板于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)40～48 h，XLD瓊脂平板于36 ℃±1℃培養(yǎng)18～24 h，觀察各個平板上生長的菌落。

1.2.6 三糖鐵試驗 自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接接種營養(yǎng)瓊脂平板，同時于陽性對照間接種沙門氏菌標準菌株陽性對照，于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察三糖鐵瓊脂及營養(yǎng)瓊脂平板上生長的菌落。

1.2.7 沙門氏菌生化鑒定試劑盒鑒定 從鋁箔袋中取出試劑盒，打開盒蓋，在試劑盒的長條槽中加入1.0 ml無菌生理鹽水，防止培養(yǎng)過程中菌懸液干燥。從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成濁度適當的菌懸液，仔細研磨，與標準0.5麥氏濁度比濁管進行比較，制成0.5麥氏濁度的菌懸液，同時于陽性對照間接種沙門氏菌標準菌株陽性對照。

使用無菌移液器吸取制備好的0.5麥氏濁度的菌懸液，分別至試劑盒的9個圓孔中，每孔接種量為0.2 ml，蓋上盒蓋，于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h，氨基酸對照、賴氨酸脫羧酶、氰化鉀對照、氰化鉀接種后需加入2～3滴無菌液體石蠟覆蓋培養(yǎng)基表面；靛基質培養(yǎng)后觀察結果時需滴加2～3滴靛基質試劑，即刻觀察結果。

2 結果

2.1 增菌

如圖1所示，經增菌培養(yǎng)18～24 h后，TTB增菌液中，陽性對照試驗管由深綠色變?yōu)闇\綠色，樣品及空白對照不變色；SC增菌液中，陽性對照試驗管由黃色變?yōu)槌壬瑯悠芳翱瞻讓φ詹蛔兩?/p>

圖1 沙門氏菌TTB增菌（左）及SC增菌（右）培養(yǎng)

2.2 分離

如圖2所示，增菌液接種BS瓊脂后，經培養(yǎng)48 h，陽性對照在平板上生長出黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色的菌落，菌落周圍培養(yǎng)基呈黑色或棕色，樣品及空白對照無菌落生長。

圖2 BS瓊脂平板上的菌落形態(tài)

圖3 XLD瓊脂平板上的菌落形態(tài)

如圖3所示，增菌液接種XLD瓊脂后，經培養(yǎng)24 h，陽性對照在平板上生長出粉紅色、帶或不帶黑色中心的菌落；大的帶光澤的黑色中心，全黑色的菌落。樣品及空白對照無菌落生長。

2.3 三糖鐵試驗

如圖4所示，自選擇性瓊脂平板上挑取的可疑菌落接種三糖鐵瓊脂，經培養(yǎng)24 h后，陽性對照在三糖鐵瓊脂斜面上，上層斜面產堿變紅，底層產酸變黃，產生硫化氫變黑，不產氣，樣品及空白對照無變化。

圖4 三糖鐵試驗結果

如圖5所示，自選擇性瓊脂平板上挑取的可疑菌落接種營養(yǎng)瓊脂，經培養(yǎng)24 h后，陽性對照在營養(yǎng)瓊脂平板上生長出白色、圓形、表面光滑、濕潤、半透明的菌落，樣品及空白對照無菌落生長。

圖5 營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落形態(tài)

2.4 沙門氏菌生化鑒定

如圖6所示，陽性對照三糖鐵瓊脂斜面有硫化氫產生，靛基質無變化，尿素無變化，氰化鉀無變化，賴氨酸脫羧酶由黃色變?yōu)樽仙瑢φ丈抽T氏菌生化反應鑒定表可知，為典型沙門氏菌屬反應；樣品及空白對照無變化。

圖6 沙門氏菌生化鑒定

3 討論

3.1 檢測樣品的污染情況

本次調查從蘭州市市售不同品牌的火腿腸中進行隨機抽樣檢測，共采樣11份，編號A～K，通過一系列增菌、分離純化及斜面培養(yǎng)后，根據菌株在平板以及斜面培養(yǎng)基上的菌落特征，與陽性對照菌株進行對照，結合沙門氏菌生理生化試驗結果，確定了11份樣品均未受到沙門氏菌污染。

3.2 沙門氏菌的現有檢測方法的局限及未來展望

近年來，隨著人畜感染沙門氏菌病例增多，食品中沙門氏菌的檢測已經成為不可或缺的一環(huán)。而傳統國標的沙門氏菌檢測方法雖然可以對沙門氏菌進行檢測，但也有檢測時間過長、檢測步驟繁瑣等缺點。隨著生物技術的發(fā)展，沙門氏菌的檢測技術也在不斷地發(fā)展進步，許多快速檢測方法開始應用于沙門氏菌的檢測，且48 h內就可檢出沙門氏菌。直到現在，已經在應用中的方法有免疫學方法（包括酶聯免疫吸附法、斑點酶聯免疫吸附、斑點免疫金滲濾法、免疫磁性分離技術、免疫熒光標記、自動酶標免疫檢測儀、葡萄球菌A蛋白協凝試驗法等）、分子生物學方法（包括聚合酶鏈反應（PCR）技術、核酸探針、擴增片段長度多態(tài)性技術、基因芯片技術、環(huán)介導等溫擴增方法、熒光定量PCR、噬菌體裂解試驗、原位熒光 LAMP 技術等）等[13]。但新技術的應用也有其局限性，免疫學方法檢測沙門氏菌經濟、高效、易于操作，但是靈敏度偏低。分子生物學方法檢測沙門菌具有快速、靈敏度高、特異性強等優(yōu)勢，但對儀器設備、試劑要求高，費用昂貴無法普及[14]。因此，目前沙門氏菌的檢測還不能完全脫離傳統方法，達到高效準確檢測出沙門氏菌的效果，開發(fā)出高效、快速、低成本、靈敏度高的沙門氏菌檢測方法仍是未來的研究方向。