sIgA細胞在初生牦牛小腸的分布研究

宋 晨，張 倩，崔 燕，何俊峰，拜占春，劉嘉琪，馬志宏

（甘肅農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070）

小腸（Small Intestine）是動物消化系統(tǒng)關鍵的組成部分之一，由十二指腸、空腸、回腸共同構成。小腸不僅能夠消化食物，而且還能夠很好地吸收營養(yǎng)物質，不僅如此，小腸同時還能起到免疫屏障的作用。當前，關于小腸組織結構進行的研究與報道，主要是集中于兔、貓、羊[1]、以及藏羚羊[2]等動物。根據這些研究報道顯示，小腸壁層的構成包括了黏膜層、黏膜下層、肌層以及漿膜，而且小腸黏膜上還具有微絨毛、腸絨毛、環(huán)形褶皺以及小腸腺等具有代表性的結構。除此之外，在小腸黏膜上面還分布有很多與黏膜有關的淋巴樣組織，包括有淋巴細胞、肥大細胞、巨噬細胞等等。小腸黏膜組織所具有的這些結構不僅能夠增大小腸黏膜的表面積，而且還可以提高小腸對營養(yǎng)物質的吸收效率，同時小腸組織中相關細胞還參與構成了腸道的免疫防御屏障，這些使得小腸黏膜兼具了良好的吸收作用和屏障功能。

消化道黏膜免疫的主要效應因子為分泌型免疫球蛋白A(secretoryIgA，sIgA)，同時消化道黏膜免疫系統(tǒng)的首要防線也是由sIgA而構成的。首先，sIgA不僅能夠中和病毒、抵御病原菌，其次，它還能夠實現免疫清除、免疫排斥。除此之外，sIgA還可以調節(jié)腸道的微生物構成情況，并且還可以促使形成得到更多的天然抗菌因子[3]。當前，關于消化道sIgA細胞分布情況的研究，主要集中在豬、家兔、雙峰駝等動物[4-6]且均已有報道。

牦牛是主要分布在我國青藏高原等地區(qū)的特有牛種之一，能夠很好地適應高寒的氣候環(huán)境。牦牛不僅僅可用于農耕，而且還能夠作為高原運輸工具，更可以為當地牧民提供奶、肉、皮毛、役力、燃料等生產生活必需品，是高原地區(qū)不可或缺的生活和經濟來源，這也使牦牛成為當地畜牧業(yè)經濟中起到支柱性作用的重要畜種。但是，由于牦牛所生活的環(huán)境多處于高原地區(qū)，自然條件特殊，環(huán)境惡劣，再加上牧區(qū)牧民的飼養(yǎng)管理技術較為落后以及病原性等因素的影響，使得犢牦牛腹瀉發(fā)病率很高，這已成為導致犢牦牛死亡最常見的病因之一。后煥文等[7]調查表明，甘南犢牦牛腹瀉平均發(fā)病率為17.57%，平均病死率則高達44.91%，這已經使當地牦牛業(yè)的健康發(fā)展受到了嚴重危害。因此，了解初生牦牛小腸的早期形態(tài)結構及sIgA黏膜免疫效應細胞的分布特征，對采取有效的措施加強初生牦牛的飼養(yǎng)管理、減少犢牦牛腹瀉疾病的發(fā)生從而降低發(fā)病率和病死率，最終對提高犢牦牛成活率具有重要意義。

綜上，sIgA細胞在初生犢牦牛小腸中的分布規(guī)律，目前還未見相關報道。因此，本研究選取初生牦牛為研究對象，研究其小腸黏膜組織結構及sIgA細胞的分布規(guī)律，以期為犢牛消化道疾病的預防、治療及疫苗的開發(fā)等方面提供重要的免疫學理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究總共選取5例健康的1～7日齡犢牦牛作為研究對象，待牦牛頸動脈放血處死之后，再剖開腹腔，自幽門后1 cm至盲腸口前0.5 cm整段截取，完整取出其十二指腸、空腸、回腸，接著再使用生理鹽水將采集的樣本都徹底沖洗干凈。之后，將每個腸段都劃分為5份，分別固定在40 g/L中性多聚甲醛溶液中，同時，對每一個腸段都做好標記。小腸組織樣全部采集自甘肅省甘南藏族自治州合作屠宰場，

SP試劑盒、DAB染色試劑盒、家兔抗IgA多克隆抗體（rabbit polyclonal to IgA）以及載玻片蓋玻片等均向某生物技術有限公司采購。

1.2 組織學切片染色觀察

對采集回來的小腸組織先進行分段處理，標明十二指腸、空腸、回腸，再對每個腸段組織進行切塊，每個組織塊約為1cm3，每個腸段各取5個組織塊。依次經過脫水、透明、浸蠟后，常規(guī)石蠟包埋，待蠟塊凝固后作適當修整，確保蠟塊的各個邊緣都是整齊的，規(guī)格大小也都是適宜的，之后將蠟塊放置到切片機上做連續(xù)切片，切片厚度均為5μm，每例各選取5片，HE染色觀察小腸基本結構。

1.3 sIgA細胞分布觀察

免疫組織化學染色使用家兔抗IgA多克隆抗體，使用時需按照 1/100稀釋之后再使用。并且在免疫組織化學的染色時，實際操作流程及步驟應當按照SP試劑盒詳細說明書進行。染色時可用0.01 mol/L的PBS緩沖液取代一抗作為空白對照，同時，應用Olympus-DP71顯微鏡在鏡下觀察陽性細胞的實際分布情況，并且拍照保存。

2 結果

2.1 初生牦牛小腸組織形態(tài)結構

通過組織切片經HE染色觀察發(fā)現，初生犢牦牛小腸壁層組織共由4層構成，分別包括黏膜層、黏膜下層、肌層以及漿膜層。黏膜層則由3層構成，包括了黏膜上皮、固有層、黏膜肌層。在顯微鏡下，可以清晰地觀察到十二指腸絨毛呈葉狀形態(tài)，相較于空腸和回腸更為粗短，且排列更為緊密(見圖1A)；空腸絨毛為長桿狀，細長且排列稀疏（見圖1B），回腸絨毛長度較短且排列稀疏，并且還可觀察到局部絨毛表面出現類似腦溝回形的皺襞（見圖1C）。小腸的絨毛上皮細胞基本上均為單層柱狀上皮細胞，并且在上皮細胞之間還散在分布有杯狀細胞和淋巴細胞。另外，小腸腺作為小腸組織的代表性結構之一，在十二指腸、空腸、回腸三者的黏膜固有層中均可觀察到。并且在十二指腸黏膜下層中可清晰觀察到十二指腸腺，空腸黏膜下層除腸腺外還可觀察到有少量散在分布的淋巴小結，呈圓形或橢圓形，著色較深。回腸黏膜下層中則可見大量集合淋巴小結。

圖1 初生牦牛小腸黏膜結構 HE染色 100×

2.2 初生牦牛小腸sIgA細胞的分布

本研究觀察到sIgA細胞在小腸各結構中均有分布，并且在腸絨毛基部固有層中的分布量最多（圖2A-C）。不同腸段當中sIgA細胞的分布情況是不相同的，十二指腸上主要分布在絨毛基部固有層以及十二指腸腺附近，空腸中sIgA細胞基本上分布在絨毛固有層之中，回腸當中則是以富含淋巴細胞的絨毛和集合淋巴小結當中為主，此外，在回腸絨毛上皮中也有少量分布。

圖2 初生牦牛小腸IgA+細胞的免疫組織化學反應 1000×

3 討論

本研究所得結果表明，初生牦牛小腸管腔組織結構從內到外共由4層構成，分別依次為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜組成。黏膜層的基本構成又可分為3層，包括了黏膜上皮、固有層以及黏膜肌層。為了增加機體對于營養(yǎng)物質的有效吸收，小腸黏膜層內的固有膜會向管腔內突起形成連續(xù)的褶皺，并且在其表面覆蓋了上皮細胞從而形成了腸絨毛，同時在顯微鏡下還可清楚觀察到肌層有內側環(huán)形肌和外側縱形肌兩層。在小腸的黏膜固有層中均有小腸腺分布其中，這是小腸的代表性結構之一。十二指腸腺緊密排列在十二指腸的黏膜下層中，空腸黏膜下層偶爾可見散在分布的淋巴小結，回腸黏膜下層中則可見大量集合淋巴小結，這些研究結果和常蘭等人[2]針對藏羚羊和藏綿羊的小腸結構所進行的研究結果是一致的，表明初生牦牛小腸結構完整，已具備一定的消化吸收能力。

黏膜免疫系統(tǒng)屬于動物免疫系統(tǒng)當中最重要的構成部分之一，此系統(tǒng)會分泌大量sIgA，sIgA則會和病原微生物抗原結合形成抗原抗體復合物。此外，其還能夠刺激消化道黏膜中的杯狀細胞，促使杯狀細胞分泌大量黏液，從而可以有效抵御并清除動物體內的各種寄生蟲[8]。根據本研究結果可知，sIgA細胞在初生牦牛十二指腸、空腸、回腸上主要分布于黏膜固有層，而在腸絨毛上的分布量較少。這個結果與楊倩等人的研究結果也相符合[9]。筆者分析sIgA細胞在小腸中這樣分布的原因可能與固有層結構疏松，從而更有利于其分泌并轉移的IgA向周圍擴散，進而可以達到更好的局部免疫效果有關。不同腸組織當中sIgA細胞的分布情況是不相同的，十二指腸上主要分布在絨毛基部固有層以及十二指腸腺附近，空腸中sIgA細胞基本上分布在絨毛固有層之中，回腸當中則是以富含淋巴細胞的絨毛和集合淋巴小結當中為主，此外，在回腸絨毛上皮中也有少量分布，本結果和車傳燕等研究結果也相符合[4]。小腸黏膜sIgA細胞無論是十二指腸、空腸還是回腸，都主要分布在腸絨毛基部的腸腺周圍，但是有一點需要注意，那就是腸絨毛下的 sIgA細胞局部密度是明顯低于腸腺周圍密度的，這樣就可以說明腸腺很可能就是sIgA進入腸腔的主要途徑，這可能為動物機體小腸不同部位發(fā)揮不同程度的免疫功能提供了重要的理論基礎。