血培養(yǎng)布魯菌在實(shí)驗(yàn)室的鑒識(shí)

李 艷

（河北省保定市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 保定 071000）

布魯菌是一類人畜共患感染性疾病的病原體，主要通過接觸染病牛羊，細(xì)菌可經(jīng)完整的皮膚黏膜進(jìn)入宿主體內(nèi)，或者食用未煮熟的染病牛羊肉或奶制品，人類普遍對(duì)布魯菌易感。布魯菌進(jìn)入人體后，首先侵犯局部淋巴結(jié)，并在淋巴結(jié)內(nèi)生長(zhǎng)繁殖形成感染灶，當(dāng)細(xì)菌繁殖到一定數(shù)量便侵入血流并釋放出內(nèi)毒素，出現(xiàn)菌血癥。外周血中培養(yǎng)出布魯菌是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[1]，抽取血液進(jìn)行培養(yǎng)是臨床醫(yī)生普遍使用且容易被病人及家屬接受的診斷方法。本文通過對(duì)151例血培養(yǎng)檢測(cè)出布魯菌的病例資料進(jìn)行回顧性分析，總結(jié)其在自動(dòng)培養(yǎng)儀上生長(zhǎng)曲線特點(diǎn)，轉(zhuǎn)種后生長(zhǎng)緩慢，菌落特征及一系列生化反應(yīng)特點(diǎn)，為檢驗(yàn)科微生物工作人員對(duì)本菌的正確識(shí)別提供參考，及早而準(zhǔn)確發(fā)放血培養(yǎng)結(jié)果，為臨床醫(yī)生提供診斷依據(jù)，防止誤診和漏診。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年8月～2019年1月我院門診及住院病人根據(jù)2012年頒布的《布魯氏菌病診療指南（試行）》確診為布魯氏菌病，外周血中均有布魯菌生長(zhǎng)的151例病人資料。虎紅平板凝集試驗(yàn)（PAT）1+至4+（1例為陰性），血清抗體微量凝集試驗(yàn)：陰性1例，1：50陽性2例，1：100陽性23例，1：200陽性22例，1：400陽性29例，1：800陽性21例，≥1：800陽性53例。臨床上表現(xiàn)為不同程度的發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛、肝脾腫大并有接觸史[2]。

1.2 儀器與試劑

VersaTREK及配套使用的需氧培養(yǎng)瓶。遼寧迪浩生物科技有限公司生產(chǎn)的布魯氏菌抗體檢測(cè)試劑盒（虎紅平板凝集法）。

1.3 標(biāo)本采集

無菌采集10 mL血液至需氧培養(yǎng)瓶中，按儀器要求的程序放入培養(yǎng)儀，培養(yǎng)儀自動(dòng)進(jìn)行。

1.4 試驗(yàn)室鑒定

VersaTREK自動(dòng)血培養(yǎng)儀發(fā)出陽性報(bào)警，查看生長(zhǎng)曲線為下降的曲線（如圖1），應(yīng)該高度懷疑布魯菌生長(zhǎng)，為防止試驗(yàn)室污染和操作人員感染，然后按照無菌操作要求在生物安全柜中進(jìn)行抽取混勻的培養(yǎng)瓶中的樣本轉(zhuǎn)種到馬血平板和伊紅美藍(lán)平板上，放置在35～37℃、5～10﹪CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)（平板上應(yīng)做好標(biāo)記，培養(yǎng)后的觀察、取菌、接種等一系列的操作都應(yīng)該在生物安全柜中進(jìn)行）。24 h后觀察血平板上有菌生長(zhǎng)但不明顯，無法辨識(shí)菌落形態(tài)。培養(yǎng)至48～72 h血平板上生長(zhǎng)出較小、突起、邊緣整齊、灰白色、濕潤(rùn)的菌落，麥康凱平板上不生長(zhǎng)。取菌涂片進(jìn)行革蘭染色，油鏡觀察可見革蘭陰性球桿菌（如圖2），沙灘樣。 尿素分解試驗(yàn)5～10分鐘出現(xiàn)陽性，氧化酶、觸酶陽性，能分解葡萄糖等糖類，產(chǎn)少量酸，能還原硝酸鹽，不分解甘露醇，不形成靛基質(zhì)，不利用枸櫞酸鹽，甲基紅和VP試驗(yàn)陰性。與布魯菌陽性標(biāo)準(zhǔn)血清發(fā)生肉眼可見的凝集反應(yīng)。

（圖1）

（圖2）

2 結(jié) 果

布魯菌在VersaTREK自動(dòng)血培養(yǎng)儀上的生長(zhǎng)曲線為下降的曲線，VersaTREK是根據(jù)感受到的培養(yǎng)瓶中氣體壓力變化自動(dòng)報(bào)警，布魯菌在生長(zhǎng)過程中消耗氣體，所以生長(zhǎng)曲線為下降曲線。151例病例最短的報(bào)陽時(shí)間為53.0 h，最長(zhǎng)報(bào)陽時(shí)間為209.7 h，平均報(bào)陽時(shí)間為82.1 h。接種到血平板上放置5～10% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)24 h，可見細(xì)菌生長(zhǎng)但無法辨識(shí)菌落特征。繼續(xù)培養(yǎng)至48～72 h，可見細(xì)小、突起、邊緣整齊、灰白色、濕潤(rùn)的菌落。革蘭染色為陰性球桿菌，沙灘樣，尿素分解試驗(yàn)5～10分鐘出現(xiàn)陽性，氧化酶、觸酶陽性，能分解葡萄糖等糖類，產(chǎn)少量酸，能還原硝酸鹽，不分解甘露醇，不形成靛基質(zhì)，不利用枸櫞酸鹽，甲基紅和VP試驗(yàn)陰性，與布魯菌陽性標(biāo)準(zhǔn)血清做玻片凝集試驗(yàn)，發(fā)生肉眼可見的顆粒凝集反應(yīng)，可推斷為布魯菌生長(zhǎng)。

3 討 論

目前，布魯氏菌病流行呈現(xiàn)新的趨勢(shì)，出現(xiàn)分散點(diǎn)狀，多發(fā)特點(diǎn)。病人多出現(xiàn)不同程度的反復(fù)發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛、肝脾腫大并有接觸史，外周血中培養(yǎng)出布魯菌是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[1]，抽取血液進(jìn)行培養(yǎng)是臨床醫(yī)生普遍使用且容易被病人及家屬接受的診斷方法。臨床醫(yī)生為尋找病源大多會(huì)進(jìn)行血液培養(yǎng)，如果在VersaTREK培養(yǎng)儀上出現(xiàn)上述特征的生長(zhǎng)曲線時(shí)，應(yīng)高度懷疑布魯氏桿菌感染，布魯菌的主要致病物質(zhì)是內(nèi)毒素。光滑型菌的莢膜有較強(qiáng)的侵襲力，細(xì)菌產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶和H2O2酶可幫助細(xì)菌能通過完好的黏膜和呼吸道進(jìn)入宿主體內(nèi)，為避免實(shí)驗(yàn)室操作人員實(shí)驗(yàn)室內(nèi)感染，后序的操作應(yīng)該在生物安全柜中進(jìn)行。

布魯菌生長(zhǎng)緩慢，本文中的151例菌株的平均報(bào)陽時(shí)間為82.1 h，最短報(bào)陽時(shí)間為53.0 h，最長(zhǎng)報(bào)陽時(shí)間為209.7 h。全自動(dòng)血培養(yǎng)儀系統(tǒng)廣泛應(yīng)用，對(duì)布魯氏菌培養(yǎng)的報(bào)道也逐漸增多。[4]

布魯菌在血平板上生長(zhǎng)緩慢，菌落特征為較小、突起、邊緣整齊、灰白色、濕潤(rùn)光滑。革蘭染色陰性球桿菌，呈現(xiàn)沙灘樣，應(yīng)與其他革蘭染色陰性桿菌相區(qū)別。布魯菌有較強(qiáng)的侵襲力，人類對(duì)其普遍易感，可通過完整的皮膚黏膜、呼吸道、消化道感染人類，常可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室污染感染，被認(rèn)為是存在極大的危害的病原菌，[5]常通過氣溶膠使微生物操作人員獲得感染，多篇文獻(xiàn)中有實(shí)驗(yàn)室暴發(fā)感染的相關(guān)報(bào)道，[6]我國(guó)也有實(shí)驗(yàn)室感染的相關(guān)報(bào)道。[7]布魯氏桿菌抵抗力強(qiáng)，如在水、土壤、糞便、皮毛肉和乳制品中可存活數(shù)周至數(shù)月。因此，對(duì)于微生物實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)人員，應(yīng)熟練掌握對(duì)布魯菌的認(rèn)識(shí)，做到早期識(shí)別，規(guī)避實(shí)驗(yàn)室感染的風(fēng)險(xiǎn)。