虎兒金植物有機硒、無機硒及Vc體外抗氧化活性研究

謝娟平, 靳文娟, 張佳瑩

(安康學院 醫學院 秦巴中藥資源研發中心,陜西 安康 725000)

硒是動物和人體中硒-P蛋白和抗氧化酶(谷胱甘肽過氧化物酶)的重要組成部分和活性中心，是GSH-Px中起氧化還原催化作用的僅有原子，能阻止和抑制自由基反應和脂質過氧化反應，被稱為“天然解毒劑”[1-3]。適量補充硒有提高免疫力，延緩衰老，防癌抗癌的重要作用。維生素C是一種強抗氧化物質，可抵御自由基對細胞的傷害，進而抵御器官傷害，保護機體功能，維生素C常被用做參照物質來評判抗氧化能力。虎兒金是秦巴山區的特有超富硒植物資源資源之一，對土壤中的硒具有極強的富集作用，經植物自身轉化，其全植物有機硒含量較高，是近年富硒植物研究的熱點之一。研究表明，來自于植物的有機硒更有利于人體吸收，具有較強的抗氧化活性，能更好的起到防病抗病的作用[1][4～7]，但虎兒金植物有機硒在抗氧化活性方面是否與無機硒及維生素C存在差異，還未見文獻報道。因此，測定與比較虎兒金植物有機硒、無機硒及Vc的體外抗氧化活性具有重要的意義[8～9]。

研究采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法，以VC為對照，對虎兒金植物有機硒、無機硒(硒標準溶液)及VC進行清除DPPH 自由基的活性研究，評價其抗氧化活性，以期為虎兒金植物有機硒抗氧化能力評價及相關產品開發提供實驗依據[11～12]。

1 實驗材料與儀器

DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)，Sigma公司；甲醇、乙醇均為分析純，天津百世化工；BS224S型分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；SY2200-T型超聲波清洗機(上海聲源超聲波儀器設備有限公司)；PF6-2非色散原子熒光分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；101-2B型電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；ML1.8-4型可調式電熱板(北京化玻醫療器械有限公司)；FW80型高速萬能試樣粉碎機(北京科偉永興儀器有限公司)；SZ-97自動三重水蒸餾氣(上海亞榮生化儀器廠)；硝酸，高氯酸，鹽酸，硼氫化鉀，氫氧化鉀，鐵氰化鉀，均為分析純；水為三重蒸餾水，氬氣，純度為99.99%。

虎兒金植物有機硒(本課題組自制，超富硒植物虎兒金中提取，氫化物發生--原子熒光光譜法測定其硒含量為75 mg·kg-1)；無機硒(硒單元素標準溶液100.0 μg·mL-1，核工業化工研究所)，維生素C標準品(VC，上海滬峰化工有限公司)。

2 實驗原理與方法

2.1 原理

DPPH (1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)法是篩選自由基清除劑的簡便方法。由于DPPH自由基具有單電子，其甲醇溶液呈深紫色，在516 nm 處的強吸收與濃度呈線性關系。當遇到抗氧化劑時，配對后溶液顏色變淺，吸光度變化與清除DPPH能力線性相關，可用于抗氧化能力的定量分析和判定。

2.2 方法

2.2.1 溶液配制 DPPH溶液配制：精密稱取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)約2.5 mg，甲醇溶解并定容至100 mL，置于棕色容量瓶中避光保存，備用。

硒單元素溶液配制：精密取濃度為100 μg·mL-1的硒標準溶液，用5%鹽酸稀釋，得2.0 μg·L-1的無機硒供試品溶液。

虎兒金植物有機硒溶液配制：準確稱取超富硒植物虎兒金中提取的植物有機硒樣品約3.7 mg，甲醇定容至100 mL，得濃度為2.775 ×10-6mg·mL-1的植物有機硒溶液。

維生素C(抗壞血酸)溶液配制：精密稱取維生素C(抗壞血酸)約2.5 mg，甲醇溶解并定容至100 m，得濃度為0.025 mg·mL-1的VC溶液，備用。

2.2.2 DPPH自由基的清除實驗 分別吸取0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL濃度為2.0 μg·L-1無機硒溶液，置于10 mL離心管中，各管依次加入0.025 mg·mL-1DPPH甲醇溶液4 mL，甲醇定容至5 mL，室溫下靜置1小時，516 nm處測定吸光度，同法做空白對照。上述操作均于避光條件進行。按以下公式計算清除率：

式中A0為DPPH空白溶液的吸光度；At為t時刻溶液中DPPH自由基吸光度。

2.3 半數有效濃度EC50和清除能力

根據虎兒金植物有機硒、無機硒及Vc清除DPPH 自由基曲線計算EC50，得到清除50% DPPH 自由基時各樣品與DPPH 的質量之比(mg·mg-1)，EC50值越小，清除自由基能力越強[5]，由EC50值大小對各樣品抗氧化能力大小進行判斷與比較。

3 結果與分析

3.1 DPPH自由基清除率

實驗測定了虎兒金植物有機硒、無機硒和維生素C對DPPH自由基的清除率，以樣品與DPPH的質量比(mg·mg-1)為橫坐標，以對DPPH自由基清除率為縱坐標作圖，結果見圖1、圖2和圖3。

從圖1、圖2 和圖3 可以看出，根據虎兒金植物有機硒、無機硒和維生素C對DPPH 自由基有明顯清除作用，均有較強的抗氧化能力，且隨著虎兒金植物有機硒、無機硒和維生素C樣品量的增加，對DPPH 自由基清除能力增強。可以看出，在實驗范圍內，隨著加入量的增加，清除能力起初增加迅速，但無機硒在質量比達到1.2×10-5mg·mg-1時清除率達到最大，此后趨于穩定；維生素C在質量比達到1.4×10-1mg·mg-1時趨于穩定，之后保持平衡。

3.2 自由基清除能力評價

從圖1、圖2 和圖3 的虎兒金植物有機硒、無機硒和維生素C對DPPH 自由基清除擬合曲線上求出EC50值，結果見表1。

表1 虎兒金植物有機硒、無機硒和維生素C的EC50

由圖1～3和表1可以看出，在DPPH自由基反應體系里，虎兒金植物有機硒、無機硒和維生素C對DPPH 自由基清除能力有明顯的差異，虎兒金植物有機硒及無機硒的EC50值僅大約是維生素C的1/(3.57×103)，即虎兒金植物有機硒和無機硒抗氧化能力幾乎是維生素C的2.8×104倍，表明虎兒金植物有機硒可作強效抗氧化劑，發揮對人體健康的保護作用。

3.3 反應時間對DPPH自由基清除的影響

實驗研究了不同反應時間下虎兒金植物有機硒、無機硒和維生素C對自由基清除能力的變化。分別選取0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的各樣品溶液，加入2.2.2項下相同量的DPPH溶液，分別于5 min、10 min、30 min、60 min、90 min時測定各樣品對DPPH自由基的清除率。以反應時間為橫坐標，以DPPH自由基清除率為縱坐標作圖，結果如圖4～6。可以看出，反應時間對虎兒金植物有機硒、無機硒和維生素C清除DPPH自由基影響很大，隨著反應時間的增加，清除率逐漸增大，30 min至60 min清除率逐漸達到最大，60 min后清除率趨于穩定。

可以看出，不同反應時間下，虎兒金植物有機硒、無機硒和維生素C對DPPH自由基清除率不同，60 min左右各物質對DPPH清除率最大，其中虎兒金植物有機硒和VC對DPPH清除率最大可達95.72%，無機硒對DPPH自由基清除率最大達93.42%，之后趨于穩定。

4 討論

筆者研究采用DPPH法測定了虎兒金植物有機硒、無機硒及維生素C對 DPPH自由基清除能力及反應時間對清除能力的影響。結果表明，虎兒金植物有機硒、無機硒及維生素C均具有較強的清除DPPH自由基能力，且隨著各物質加入量的增加而增強，最終趨于穩定。從EC50值來看，虎兒金植物有機硒、無機硒對自由基清除能力遠遠高于維生素C。

可以看出，虎兒金植物有機硒的抗氧化能力更強于無機硒，但有機硒因來源于植物，經植物自身成長過程中的轉化，更有利于人體吸收，可望在抗氧化、清除有害自由基保護人體健康方面發揮更大的作用，實驗探索結果可對虎兒金植物有機硒開發應用提供一定參考。