響應(yīng)面法優(yōu)化微波-輔助提取金銀花中綠原酸工藝研究

侯敏娜,侯少平,劉艷紅,王珊,許海燕,彭修娟

(陜西國際商貿(mào)學(xué)院, 陜西 咸陽 712046)

金銀花(LoniceraJaponica)，又稱雙花、金花、銀花，為忍冬科忍冬屬忍冬組植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花[1]。具有清熱解毒、消腫止痛的功效[1]，主要用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱血毒痢、風(fēng)熱感冒和溫病發(fā)熱等癥[2～4]。植物中的綠原酸具有抗菌、抗病毒等藥理活性，也是金銀花中主要成分，也是市售中成藥感冒藥中含有的成分。隨著醫(yī)學(xué)發(fā)展的研究，人們對于金銀花的理解也越來越深，對金銀花的利用程度也隨之提高。筆者研究利用微波法從金銀花中提取得到的綠原酸工藝，將為金銀花藥材合理、廣泛利用提供實驗技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花(購于河南省密縣，經(jīng)我院中藥學(xué)教研室雷國蓮教授鑒定為Lonicerajaponica)；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定研究院，批號：110753-201415)；95%EtOH(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；NaOH(天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠)等，試劑均為市售分析純。

TU-1810型紫外-可見分光光度計(上海長城制造有限公司)；FA2004A型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；HH-2型恒溫水浴鍋(江蘇金壇市億通電子有限公司生產(chǎn))；XH-200A型微波萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；TDL-60B型高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠制造)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 金銀花中綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 將綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品放入恒溫干燥箱中，于105℃干燥后常溫放涼以備用。準(zhǔn)確稱取預(yù)先處理好的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0.005 g，先加入少量70%的乙醇使其充分溶解，隨后再定容至刻度。分別精密移取上述配置好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液1、2、3、4、5、6 mL，置25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，于用波長為327 nm處的紫外光光下，測各吸光度[5,6]。以吸光度A(y)和濃度C(x)在excel表格中繪作其標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，綠原酸濃度在4～24 mg·mL-1范圍內(nèi)，與吸光度線性關(guān)系良好。

1.2.2 金銀花中綠原酸提取方法及含量計算 稱取100 g金銀花清洗，低溫烘干，粉碎，過二號篩，封存?zhèn)溆谩＞_稱取2.000 g金銀花粉末，于100 mL燒杯中，加入適量一定濃度的乙醇，浸泡10 min，使其充分浸透后，經(jīng)微波提取后過濾，濾液定容至250 mL容量瓶中。從其中移取2 mL，定容于50 mL容量瓶中。在波長327 nm處，測其吸光度，根據(jù)公式，計算，可得綠原酸提取率(Y)[6～8]。

綠原酸提取率(Y)=CVn/1000m×100﹪

其中，C為樣品溶液濃度，mg·mL-1；V為體積，mL；n表示樣品轉(zhuǎn)為原液的倍數(shù)；m表示金銀花粉末的量，g[8]。

1.2.3 單因素考察[9～12]精確稱取金銀花粉末適量，于100 mL燒杯中，加入適量一定濃度的乙醇，浸泡10 min，使其充分浸透后，經(jīng)微波法提取。通過考察溶液的pH值(3、4、5、6、7)；乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)；料液比(1∶6 g·mL-1、1∶8 g·mL-1、1∶10 g·mL-1、1∶12 g·mL-1、1∶14 g·mL-1)和提取時間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)等因素，對金銀花中綠原酸提取率(Y)的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實驗優(yōu)化 通過單因素實驗考察結(jié)果及響應(yīng)面中心組合的方法，以金銀花中綠原酸提取率為響應(yīng)值(Y)，以溶液的pH值(A)、乙醇濃度(B)、料液比(C)和提取時間(D)為選取的對金銀花中綠原酸的提取率(Y)的影響較大的四個因素。每個因素水平分別用-1、0和1表示低、中、高三個水平，設(shè)計29組實驗。見表1。

表1 實驗因素水平

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Design- Expert8.0.6軟件分析、處理實驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 溶液的pH值對金銀花中綠原酸提取率的影響 由圖2可明顯看出，PH值在小于5時提取率隨著pH值升高而增加，且增加趨勢度較快，在曲線上顯示為斜率較大；但超過5以后，提取率開始逐漸減小，且pH值為5～6之間下降最大，負(fù)斜率超過了增加時的斜率。故選擇溶液的pH值等于5時，為金銀花中綠原酸提取溶液pH值的最優(yōu)取值。

2.1.2 乙醇濃度對金銀花中綠原酸提取率的影響 由圖3可明顯看出，橫坐標(biāo)上乙醇濃度分?jǐn)?shù)變大，金銀花中的綠原酸提取率在最初先上升隨后出現(xiàn)了下降的情況，當(dāng)達(dá)到中值70%的時候，與此對應(yīng)的綠原酸的提取率達(dá)到了該條件下的最大值。當(dāng)高于70%時呈明顯急劇下降趨勢，可能是由于乙醇濃度高時引入的雜質(zhì)比較多或抑制了一部分綠原酸的溶出。故選擇70%的乙醇，為提取金銀花中綠原酸的最優(yōu)乙醇濃度取值。

2.1.3 料液比對金銀花中綠原酸提取率的影響 由圖4可明顯看出，隨著橫坐標(biāo)上料液比越來越大，金銀花中綠原酸提取率越來越高，當(dāng)料液比小于1∶12 g·mL-1，提取率成正增長趨勢；當(dāng)料液比大于1∶12 g·mL-1時提取率逐漸降低趨勢。故選擇料液比為1∶12 g·mL-1，為金銀花中綠原酸的最優(yōu)溶劑提取用量取值。

2.1.4 提取時間對金銀花中綠原酸提取率的影響 由圖5可明顯看出，在其他條件恒定不變的情況下，當(dāng)微波時間為30 min時，提取出的金銀花綠原酸量最多，在20 min和30 min之間斜率最大，但提取時間超過30 min后，可能隨著時間的增加，綠原酸會部分分解使提取率開始逐漸減小。故選擇時間為30 min，為金銀花中綠原酸的最優(yōu)提取時間取值。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗結(jié)果與分析

2.2.1 二次回歸模型方程的建立及方差分析 以金銀花中綠原酸提取率(Y)為考察指標(biāo)，結(jié)合單因素實驗結(jié)果，對溶液pH值(A)、乙醇濃度(B)、料液比(C)和提取時間(D)四個因素對金銀花中綠原酸的提取率(Y)的影響，設(shè)計29組實驗，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計實驗數(shù)據(jù)

利用Design-Expert8.0.6軟件對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到Y(jié)(金銀花中綠原酸的提取率)與A(溶液的pH值)、B(乙醇濃度)、C(料液比)和D(提取時間)的二次多元回歸方程如下：

Y=+9.65+0.17A+0.030B-0.12C+2.979E-003D-0.18AB+0.068AC-0.083AD-0.087BC-0.039BD+0.015C D-0.19A2-0.022B2-0.12C2-0.024D2

表3 方差分析

由表3數(shù)據(jù)顯示，可以明顯看出，模型組的P值小于0.0001，說明該回歸方程有顯著性，同時R2為0.9653，說明了有96.53%的數(shù)據(jù)合理有效；F=3.16、P=0.1596，大于0.01，代表了失擬項并不顯著，說明了方程可以較好的模擬試驗內(nèi)容，且變異系數(shù)遠(yuǎn)小于10%的閾值，說明此回歸方程的精度較高。綜上所述，可以認(rèn)為回歸方程合理、精確，可以用于預(yù)測金銀花中綠原酸微波提取工藝、說明實驗的可行性。

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 根據(jù)回歸分析結(jié)果，使用Design-Expert 8.0.6軟件繪制出相應(yīng)的響應(yīng)面圖和等高線圖，結(jié)果見圖6～圖9。

根據(jù)圖6可知，溶液的pH值和料液比都顯得很陡峭，這說明pH值和料液比的交互作用對最終結(jié)果的影響非常大。從等高線圖可知，相對來說料液比對結(jié)果的影響更大。由此，可確定溶液的pH值在5.0～5.50和料液比在1∶10～1∶14 g·mL-1范圍時，金銀花中綠原酸提取率達(dá)到了最高水平。

根據(jù)圖7的分析得出，溶液的pH值以及乙醇濃度的響應(yīng)面曲線均比較尖銳，說明溶液的pH值和乙醇濃度對金銀花中綠原酸提取率影響均比較大。且乙醇濃度對其影響更大一些。由此，可確定溶液的pH值在5.0～5.50和乙醇的濃度60%～80%范圍時，金銀花中綠原酸提取率達(dá)到了最高水平。

由圖8可知，響應(yīng)面曲線中溶液的pH值和提取時間都顯得很陡峭，說明溶液pH值和提取時間的交互作用對最終結(jié)果的影響非常大。由等高線圖分析，可知提取時間其影響更為明顯一些。由此，可確定溶液的pH值在5.0～5.50和提取時間在20～35 min范圍時，金銀花中綠原酸提取率達(dá)到了最高水平。

由圖9響應(yīng)面圖可以明顯看出，乙醇濃度和料液比的曲面都比較陡，說明乙醇濃度和料液比對金銀花中綠原酸提取率影響均較大，且料液比的影響更為顯著一些。由此，可確定乙醇濃度在60%～80%和料液比在1∶10～1∶14 g·mL-1范圍時，金銀花中綠原酸提取率達(dá)到了最高水平。

經(jīng)求導(dǎo)得出最優(yōu)工藝，即溶液的pH=5.03，提取時間20 min，乙醇的濃度80%，料液比1∶10.11 g·mL-1時，金銀花中綠原酸提取率預(yù)測值為9.77285%。

2.3 工藝驗證

綜合考慮操作的可行性，在對最優(yōu)結(jié)果進(jìn)行驗證時，將實驗各因素修正為：溶液的pH值=5.0，提取時間20 min，乙醇濃度80%，料液比1∶10 g·mL-1?；谛拚^的數(shù)據(jù)，開展三次平行驗證試驗。稱取2.00 g的金銀花粉末, 按照上述最優(yōu)結(jié)果進(jìn)行微波輔助提取, 平行操作三次，按“1.2.2” 項下方法測定金銀花中綠原酸的提取率(結(jié)果見表4)，經(jīng)計算可得其實際得率為9.77266%，與理論值相差0.00019%，說明響應(yīng)面法得出的試驗條件具有很高的可靠性。

表4 工藝驗證結(jié)果

3 結(jié)論

筆者研究了微波法提取金銀花中綠原酸工藝。通過單因素實驗考察，以金銀花中綠原酸提取率為響應(yīng)值，結(jié)合響應(yīng)面法四因素三水平，共設(shè)計了29組實驗。綜合考慮把修正后實驗因素，經(jīng)三次平行操作驗證，得到的最佳提取工藝參數(shù)為，即溶液的pH=5、乙醇濃度為80%，料液比為1∶10 g·mL-1，提取時間為20 min時，金銀花中綠原酸實際提取率為9.772 66%，與預(yù)測值9.772 85%，相差很小。說明該方法可行、可用于金銀花中綠原酸提取。通過筆者試驗研究可以為金銀花中藥材臨床合理、有效、廣泛利用，提供了實驗技術(shù)支持。