桑蟥DNA條形碼與系統進化分析

楊金宏

(安康學院 陜西省蠶桑重點實驗室，陜西 安康 725000)

桑蟥(RondotiamencianaMoore)又稱桑蠶、白蠶、白蟥、松花蠶等，是鱗翅目家蠶蛾科昆蟲，寄主桑、枸、褚等，以幼蟲在葉背食害葉肉，蛀食成大小不一的孔洞，嚴重的只剩葉脈，曾是我國蠶桑生產的大敵。近年尤其是發現桑蟥對氨基甲酸酯類農藥敏感和種群擴散能力較弱后，經有效治理，猖獗一時的桑蟥漸趨消亡。浙江湖州、嘉興等地，自2004年就沒有發現桑蟥的蹤跡，其它地區也未見有桑蟥危害的報道[1]。但2013～2014年，研究人員在安徽省桑園采集到樣本，并提取了DNA[2]。2014年江蘇省也發現了該害蟲，并對其蟲卵的孵化進行了研究[3]。陜西省蠶桑歷史悠久，野桑蠶資源豐富，近年來桑蟥危害也有零星發生，對其線粒體基因組進行全長測序并分析了其進化地位[4]。

桑蟥是蠶桑生產的害蟲，但也是一種重要的絹絲昆蟲，也能吐司結繭，在距今5 500～6 000年的仰韶文化時期，我們的祖先曾經飼養過它們[5]。但與其它絹絲昆蟲如家蠶(Bombyx mori)和柞蠶(Antheraea pernyi)相比，我們對桑蟥種質資源遺傳背景的了解仍十分有限。而且由于目前桑蟥的發生規模較小，容易被植保人員忽視，DNA條編碼可以有效實現物種的鑒定、新種和隱存種的發現以及高級階元演化關系的重建等[6]。COI基因是動物線粒體細胞色素C 氧化酶Ⅰ亞基基因，因其序列變異適中，長度合適，可以應用通用引物擴增，在物種鑒定方面的優勢備受學術界關注，并在哺乳動物、鳥類、魚類、軟體動物以及昆蟲等物種鑒定研究中得到認可[7]。因此筆者對桑蟥的DNA條形碼基因COI部分序列進行PCR擴增和測序，并以此作為對其進行種屬鑒定的依據，進一步對其分類和系統進化等進行研究，為了更多的了解、有效利用仍處于野生狀態的桑蟥資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑蟥成蟲采自秦巴山區。通用基因組提取試劑盒、EX Taq DNA聚合酶、dNTPs、膠回收試劑盒、pMD18-T vector、DL2000等購自TaKaRa公司，宿主菌JM109由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 桑蟥DNA的提取和COI基因的PCR擴增 取桑蟥成蟲頭部置于研缽中，加液氮冷凍研磨，通用基因組提取試劑盒提取基因組DNA。以此DNA為模板，以昆蟲線粒體COI基因通用引物LYQ3(5’-CCTGGATCTTTAATTG -GAGA-3’)和LYQ4(5’-GGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3’)進行PCR擴增擴增桑蟥線粒體COI基因[8]。反應體系為50μL，包括10×PCR buffer 5μL、dNTPs 2 μL、25 mmol·L-1MgCl2 4.0 μL、10 pmol·μL-1F、R引物各1.5 μL、Premix LA Taq(TAKARA)0.4 μL、DNA模板20ng。反應程序為：94℃預變性4 min；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，30 個循環；最后72℃延伸10 min。擴增產物進行1.0% 瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色觀察。

1.2.2 COI基因克隆與序列測定 PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，按膠回收試劑盒說明進行回收。并將回收產物與pMD18-T vector相互連接，轉化JM109感受態菌株，涂布于加有氨芐青霉素、IPTG、X-gal 的平板上，培養12～14 h。挑取白色單菌落于LB 液體培養基中培養，堿裂解法抽提質粒，并送上海生工武漢測序部進行測序。

1.2.3 COI基因序列分析 編碼蛋白的氨基酸序列根據無脊椎動物線粒體遺傳編碼進行；利用NCBI在線BLAST程序在核酸數據庫和線粒體數據庫進行同源性分析；ClustalX程序對獲得的COI基因片段進行序列對齊，并去除各序列兩端多余的核苷酸。堿基組成偏度根據公式AT偏度=(A-T)/(A+T)和GC偏度=(G-C)/(G+C)進行計算；利用MEGA X軟件進行多態性位點分析，基于Kimura-2-Parameter(K2P)雙參數模型計算序列間的變異度，分別采用距離法和類平均聚類法構建系統樹[9]。

2 結果與分析

2.1 桑蟥COI基因的PCR擴增和克隆測序

以線粒體DNA為模板，利用引物對LYQ3、LYQ4進行PCR擴增得到一條清晰的特異條帶(圖1)。克隆至PMD18-T載體并進行測序，序列拼接后得到618 bp片段 (GenBank登錄號：JX195182)。根據無脊椎動物線粒體遺傳編碼推斷該序列中無終止密碼子和移碼突變，基因編碼206個氨基酸，所得序列為線粒體COI基因片段。

2.2 桑蟥CO I基因序列分析

利用在線BLAST程序進行序列的同源性分析，結果不同個體桑蟥的COI基因序列完全一致，與家蠶和野桑蠶該段線粒體基因序列的一致性達99%。對其堿基組成情況進行分析，結果見表1。桑蟥COI基因序列中堿基T的含量為38%，堿基C的含量為15.6%，堿基A的含量為32.2%，堿基G的含量為13.9%，A+T的含量為70.2%，與蘇州野桑蠶和安康野桑蠶線粒體COI基因該區段的A+T含量相同，較其他野桑蠶和家蠶的A+T含量低。在密碼子的堿基使用頻率上，桑蟥和野桑蠶、家蠶的密碼子第1、2位的A+T含量均相同，而密碼子第三位上，桑蟥的T含量最高，為14.2%，南充、榮昌和青木關野桑蠶為14.1%，其他野桑蠶和家蠶T含量為13.8%和13.9%。對各COI基因序列堿基組成的Skewness分析結果見表1，桑蟥COI基因序列的AT偏向度最高為-0.083，較野桑蠶和家蠶更偏好于使用T。GC偏向度分析沒有表現出類似的傾向。

2.3 桑蟥與其他蠶類昆蟲基于COI的序列比較

對來自蠶蛾科和大蠶蛾科共9個蠶類昆蟲的10條NCBI公開的COI基因序列進行分析，比對后產生574 bp的對齊序列，其中有保守性位點419個，變異位點48個，簡約性信息位點107個。2個不同桑蟥個體的COI基因完全一致，序列一致性100%。在氨基酸組成上，全部10條序列共有13個位點發生變異，而蠶蛾科昆蟲間只有2個氨基酸發生變異。

表1 COI基因序列的堿基組成及偏好性

在蠶蛾科的3種蠶類昆蟲中，桑蟥與野桑蠶的親緣關系最近，共鑒定到2個轉換核酸位點，桑蟥與家蠶間共鑒定2個顛換位點，4個轉化位點，而野桑蠶和家蠶間則發生了4個為位點的變化。與大蠶蛾科蠶類昆蟲的變異位點較多，與柞蠶和印度柞蠶分別鑒定69和82個變異位點，與栗蠶、柳蠶間有90和74個變異位點，與大烏桕蠶、蓖麻蠶間有83和80個變異位點，變異位點情況見表2。基于K2P計算各蠶類昆蟲間的遺傳距離見表2，桑蟥與野桑蠶間的遺傳距離為序列的遺傳距離為0.003，與家蠶的遺傳距離為0.011，與大蠶蛾科栗蠶的遺傳距離最大，為0.179，與柞蠶的遺傳距離最小為0.135。

表2 9種蠶類昆蟲的遺傳距離(下三角)與發生的顛換/轉換數(上三角)

2.4 基于桑蟥和其他蠶類昆蟲的COI基因的分子進化樹

利用MEGA X軟件基于K2P遺傳距離構建了9個蠶類昆蟲的COI基因序列的進化樹。在根據NJ法和UPGMA法得到的分子樹(圖2)中，大蠶蛾科和蠶蛾科昆蟲明顯分為兩個支系，桑蟥與野桑蠶聚合在一起后在共同與家蠶聚合。大蠶蛾科的昆蟲又分2個支系，一個包括柳蠶、柞蠶和栗蠶，另一個是蓖麻蠶和大烏桕蠶，與傳統分類學的研究結果一致。

3 討論

鱗翅目昆蟲是昆蟲綱的第二大目，全世界已知約180 000種，是哺乳動物的30倍，但尚有30萬鱗翅目昆蟲有待我們去發現、描述和命名，因此其物種鑒定任務復雜而艱巨[10]。目前，鱗翅目有卷蛾科、弄蝶科、毒蛾科、夜蛾科、鳳蝶科、天蠶蛾科等進行過DNA條形碼研究[11]，Hebert等[7]分析200個親緣關系較近的鱗翅目昆蟲長為658 bp的COI片段，結果表明COI片段能夠100%成功鑒別各昆蟲。根據882個鱗翅目昆蟲推算鱗翅目昆蟲間遺傳差異為6.6%，DNA條形碼可以廣泛用于鱗翅目昆蟲的分類和鑒定[12]。家蠶和野桑蠶的線粒體以及COI基因已進行了比較多的研究，桑蟥與家蠶和野桑蠶同屬家蠶蛾科，本研究解析了桑蟥COI基因5’端的618 bp的序列，經BLAST比對該片段與野桑蠶和家蠶序列的一致性達99%，而在使用的574 bp堿基的比對中，桑蟥與野桑蠶的吻合程度最高，這表明二者非常相近。但桑蟥較家蠶和野桑蠶更偏好于使用堿基T，本研究采用的LYQ3和LYQ4通用引物可以有效的擴增，并且不同桑蟥個體的基因完全一致，說明該片段可以作為DNA條形碼進行桑蟥種的鑒別。

同時本研究利用解析的桑蟥DNA條形碼探討的其與其它蠶蛾科和大蠶蛾科的蠶類昆蟲系統進化關系，結果桑蟥首先和野桑蠶聚在一起，然后再和家蠶聚在一起，說明桑蟥COI序列與野桑蠶更相近。目前國際公認的研究結果是家蠶、野桑蠶為同一祖先[13]，但因同為蠶蛾科的桑蟥的系統發育研究報道較少，而家蠶和野桑蠶分化后，家蠶進行了長期的人工選擇，而野桑蠶和桑蟥所處的野外環境及其進化壓力比較一致，也可能是造成二者比較相近的原因，但桑蟥與野桑蠶和家蠶的進化關系還有待更多的證據來證明。