高通量測序在孕早期自然流產中的應用

張華，楊黎明，袁路，劉敏，張富青

（鄭州市婦幼保健院 生殖遺傳科,河南 鄭州 450012）

孕早期自然流產在所有臨床妊娠中的發生率約為15%～20%［1］,大多數流產發生于妊娠前10周。引起自然流產的原因眾多,常見的包括內分泌因素,解剖因素,免疫因素,微生物感染,遺傳因素,男性因素。其中,遺傳因素尤其是胚胎染色體異常被認為占所有自然流產的50%～65%［2-4］。因此,流產絨毛染色體檢測對于明確流產原因是至關重要的。

高通量測序技術（high throughput sequencing）也稱為二代測序（next generation sequencing,NGS）技術,它是對傳統測序技術革命性的改變。可一次進行全基因組水平DNA 序列測定,具有檢測周期短,高通量,高分辨率,高敏感性和高準確性等優勢,不僅能檢出染色體非整倍體,還可檢出＞100 kb 的染色體基因組拷貝數變異（copy number variations,CNVs）。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2018 年1 月至2019 年9 月在鄭州市婦幼保健院生殖遺傳科就診并成功進行流產絨毛染色體分析的自然流產患者520 例?；颊呔鶎Ρ狙芯恐橥?孕周小于12 周,既往月經規律,無孕期感染史。

1.2 研究方法

凱杰試劑盒提取絨毛組織DNA 后進行文庫構建,用NextSeq CN500 測序儀進行測序。數據分析參照DGV :http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home,OMIM：http://omim.org/,DECIPHER:http://decipher.sanger.ac.uk/,PubMed:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed。變異分析參照HGMD ClinVar 和ACMG。

2 結果

520 例流產絨毛中,201 例染色體結果正常,319 例異常,異常率為61.3%。染色體非整倍體295 例（56.7%）,致病性染色體拷貝數變異24 例（4.6%）。異常核型中,出現頻率從高到低依次為：常染色體三體（包括嵌合型）（64.6%）,三倍體（10.7%）,X 單體（8.8%）,致病性CNVs（7.5%）。見圖1。

圖1 異常絨毛染色體核型分布頻率

2.1 常染色體三體

共檢出206 例常染色體三體,包括189 例純合三體和17 例常染色嵌合三體。除1 號染色體三體未檢出外,其余常染色體三體均檢出,但它們分布頻率差異較大。最常見的三種常染色體三體是16 三體（28.8%）,22 三體（10.5%）和15 三體（8.4%）,見圖2。在17 例嵌合型三體中,16 三體嵌合比例最高。

圖2 常染色體三體核型分布

2.2 三倍體和四倍體

三倍體占所有異常核型的10.7%（34/319）。四倍體占所有異常核型的1.6%（5/319）,其中一例是嵌合型：92,XNNN/46,XN。

2.3 單體型

主要為X 單體,占所有異常核型的8.8%（28/319）,未發現純合常染色單體型,發現一例嵌合型,即45,XN,-22/46,XN。

2.4 復合三體型

共發現14 例復合三體型,占所有異常核型的4.4%,見表1。

表1 14 例復合三體型

2.5 染色體拷貝數變異

共檢出24 例致病性染色體拷貝數變異（CNVs）,占所有異常核型的7.5%（24/319）。主要涉及的染色體為1 號,4 號,8 號和10 號。其中1 例證實來源于其平衡易位的父親。

3 討論

自然流產的病因是極其復雜的,包括內分泌因素,生殖道畸形,感染因素,免疫因素,遺傳因素及一些還未闡明的其他因素。盡管醫學在不斷進步,但孕早期自然流產依然是一個重要的健康問題。尤其是隨著國家二胎政策的放開,許多年紀較大的夫婦選擇再次生育。他們面臨的問題不僅是能否順利懷孕,更多的可能還面臨著早期流產的風險。這給很多家庭帶來了沉重的心理和經濟負擔。對流產絨毛進行遺傳學檢測不僅可以明確流產原因,還可為遺傳咨詢和再次妊娠提供有用信息：如果絨毛染色體結果正常,則可從其他方面查因；如果絨毛染色體結果異常,則可避免不必要的檢測和錯誤的治療方案,科學指導下次妊娠；如果意義未明,建議追查父母染色體,一般認為,來源于父母的變異不是導致流產的原因。

檢測流產絨毛染色體的方法主要有三種：染色體核型分析,染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis,CMA）和高通量測序法。染色體核型分析是目前公認的檢測染色體異常的金標準,能檢測46 條染色體的數目異常和大的結構異常（包括平衡性結構異常）,但其在應用中存在諸多缺點。首先,核型分析需要進行絨毛細胞培養,檢測周期長,對標本質量要求較高,如污染可導致培養失敗而得不到檢測結果。其次,由于整個流程都是人工操作,對操作人員的技術要求較高,而穩定性較差。此外,核型分析分辨率有限,不能檢出染色體拷貝數變異,對＜5%低比例嵌合的檢出率也較低。CMA 是一種快速有效的染色體分析技術,通過一次實驗就能檢出全基因組內的非平衡性染色體異常,但其缺陷是通量低,檢測成本高。另外,由于其依賴探針雜交,對于探針未覆蓋區域的異常無法檢出。高通量測序對標本質量要求低,用量小,周期短,通量高,可通過對測序深度的調整檢測＞100 kb 以上的染色體拷貝數變異,逐漸應用于流產絨毛染色體的檢測。

本研究運用高通量測序技術對520 例流產絨毛進行檢測,共檢出異常核型319 例,異常率為61.3%。據報道,傳統細胞學方法對異常核型的檢出率為50% 左右,如李春艷（51.72%）［5］,朱蕊（47.3%）［6］,沈素巖（51.2%）［7］,李金鴿（51.92%）［8］。筆者的研究結果表明,高通量測序的異常檢出率明顯高于細胞學方法,提高約10%。即便如此,流產絨毛的染色體異常率仍可能被低估,因為自然流產發生的孕周較早,有一些甚至在臨床上還未發現妊娠時就已經發生了自然流產。

純合三體型占異常核型的59.2%,該結果與其他報道一致［9-11］。導致染色體三體的主要原因是生殖細胞在減數分裂時染色體出現不分離。筆者發現了除1 號染色體外的所有常染色體三體型。出現頻率最高的三種三體型依次是16 號三體（也被稱作“流產染色體”）,22 三體,15 三體。出現頻率最低的三種三體型依次是4 號三體（1 例）,19 號三體（1 例）,5 號三體（2 例）。其他研究報道中,1 號和19 號染色體三體的頻率也是最低的。JENDERNY［12］的390 例研究和DU［13］的781 例研究中均未發現1 號和19 號染色體三體型。一項包含5 555 例的大樣本研究也未發現1 號染色體三體［14］。PYLYP［15］的研究報道了1 號染色體三體,但其數量及母親年齡、孕周均沒有描述。為什么這兩條特定染色體三體出現頻率極低？PELLESTOR［16］的研究結果顯示大號染色體不分離的幾率很低,這或許可以解釋為什么1 號染色體三體出現頻率極低。此外,目前的研究表明1 號染色體所承載的基因十分密集［17-18］,19 號是所有染色體中基因最密集的染色體［19］,這兩條染色體的三體將導致嚴重的遺傳不平衡,可能是極早期流產的遺傳因素,但極早期流產很難取材進行遺傳學分析。復合三體型占所有異常結果的4.4%。并沒有發現特殊組合的三體型,說明復合三體型中所涉及的兩條染色體的組合都是隨機的。

第二大類型的絨毛染色體異常是三倍體。據報道,三倍體占所有臨床妊娠的2%～3%,但超過99%的胎兒會在孕早期或孕中期丟失,妊娠至16周的胎兒中大概只有1/30 000 的概率是三倍體［20］。而WICK［21］在2003 年發表的文章報道他們中心一年內發現了4 例孕中期才被診斷出的三倍體胎兒,我國也有數例類似報道［22-24］,說明某些三倍體可能存活時間更長。本研究發現34 例流產絨毛染色體結果為三倍體,占所有異常結果的6.5%。國外的研究表明父源性的三倍體遠高于母源性的［25-26］,國內對這方面的研究報道極少,我們將在以后的工作中開展這方面的研究。

X 單體占所有檢測樣本的5.4%,占異常樣本的8.8%。該頻率在各個研究報道中比較穩定。這可能是由于胎兒患X 單體的風險不受母親年齡的影響,而是由父源性性染色體的丟失導致的［27］。純合常染色體單體的報道主要集中在13 號,15 號和21 號染色體,其中,報道最多的是21 號染色體單體。JENDERNY［12］報道了2 例純合性21 號染色體單體和1 例嵌合型21 號染色體單體,SHEARER［14］報道了1 例13 號染色體單體,1 例15 號染色體單體和11 例21 號染色體單體。筆者的研究未發現純合常染色體單體,發現1 例嵌合型22 號染色體單體,即45,XN,-22/46,XN。我們注意到,常染色體單體中所涉及的13,15,21 和22 號染色體,在三體型中發生率也較高,其發生機制還不清楚,有待于進一步的探究。

CNVs 在人類基因組中是普遍存在的,盡管大多數都是良性的或者意義未明的,仍有相當數量的染色體拷貝數變異與人類疾病密不可分,包括數百種微缺失微重復綜合征,智力缺陷,自閉癥,精神分裂癥等［28-31］。本研究共檢出染色體拷貝數變異65 例,24 例為明確致病性變異。結果表明,染色體拷貝數變異對孕早期流產的影響為4.6%（24/520）,而這部分畸變無法被傳統檢測方法識別。1 例絨毛染色體結果為1 號染色體長臂末端缺失16.68 Mb,10 號染色體長臂末端重復16.32 Mb。該結果提示其雙親之一可能為1 號和10 號染色體平衡易位攜帶者。夫妻雙方在外院染色體檢查結果顯示正常,筆者懷疑其可能被漏診,因此本院再次做高分辨染色體檢查。結果顯示,女方染色體結果為46,XX,男方染色體結果為46,XY,t（1；10）（q41；q25.1）。因此,絨毛染色體拷貝數檢測不僅可以明確流產原因,還可對父母染色體異常有所提示。如果絨毛染色體涉及到兩條染色體異常,一條片段重復,一條片段缺失,其父母可能為平衡易位攜帶者；如果同一條染色體同時存在缺失和重復,其父母可能為倒位攜帶者。染色體異常患者再次妊娠時,應告知其自然受孕時胚胎染色體異常的概率,必要時,建議其進行三代試管。

綜上所述,絨毛染色體異常仍然是導致孕早期自然流產的主要原因,異常率高達61.3%。高通量測序是檢測絨毛染色體的有力工具,可檢出4.6%染色體拷貝數變異。應重視流產絨毛染色體檢查,以明確流產原因,指導下次妊娠,并為遺傳咨詢提供有用的信息。