結腸癌組織中HBO1的表達變化及其意義

賈紅兵，王巍

（錦州醫科大學附屬第一醫院 普外科,遼寧 錦州 121000）

結腸癌是中老年人最常見的惡性腫瘤之一,且近些年有年輕化的趨勢,雖然隨著胃腸鏡技術的發展結腸癌早期確診率有所提高,使得死亡率有所下降,但是部分結腸癌患者仍可在早期即可通過淋巴道、血液等方式進行轉移。目前手術治療仍然是治療結腸癌的最有效方式,但結腸癌術后易復發、轉移,其遠期療效仍不理想。因此尋找診斷及評估結腸癌預后的新腫瘤標志物具有重要意義。近年來,有多項研究表明組蛋白乙酰轉移酶MYST 家族中的組蛋白乙酰轉移酶結合至起源識別復合物1（HBO1）在乳腺癌、胃癌、睪丸腫瘤以及卵巢腫瘤組織中呈現出高表達狀態,但是就HBO1 在結腸癌組織中的表達情況的研究還比較少見。本研究應用蛋白質印跡法（Western blot）實驗方法來檢測人結腸癌組織中HBO1 的表達情況,并且與臨床病理資料相結合進行分析,探討其在結腸癌發生、發展過程中可能的作用及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本

2018 年5 月至2019 年5 月在錦州醫科大學附屬第一醫院確診并行結腸癌切除術的60 例患者手術切除的結腸癌組織及其癌旁正常組織標本。其中男32 例,女28 例；年齡40～80 歲。所有患者手術前均未進行過任何腫瘤相關治療,所有標本均經過病理科檢測證實為結腸癌。手術切除后立即留取癌組織及與之匹配的癌旁正常結腸組織,經液氮冷凍后于-80℃冰箱中進行保存備用。本研究經錦州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑

HBO1 鼠抗人一抗（購自ImmunoWay 公司）；羊抗鼠熒光二抗（購自EarthOX 公司）；內參抗體甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（購自EarthOX公司）。其余試劑購自碧云天生物技術公司。

1.3 主要儀器與設備

美國Bio-Rad 基礎電泳儀164-5050、美國Bio-Rad ChemiDoc MP System 全能型成像系統、德國Sigma 3-30k 超高速臺式冷凍離心機、美國SONICS VCX105 超聲波細胞破碎儀、美國BioTek Synergy H1 全功能微孔板檢測儀、美國伯騰Biotek H1 多功能酶標儀、中國海爾-86℃低溫冰箱DW-86L490、中國Tanon VE586 轉移電泳槽。

1.4 方法

①組織總蛋白的提取。50 mg 組織加入300 μL RIPA 裂解液,裂解,小剪刀盡量剪碎組織,超聲粉碎后靜置20 min 后4℃離心20 min。吸取上清液使用BCA 蛋白定量法測定蛋白濃度。制樣,在蛋白樣本中加入適量的上樣緩沖液,使得蛋白樣本定量為4 μg/μL。②制膠、上樣及電泳。各孔等量上樣,各孔50 μg,第一遍加入5 μL Marker,以恒壓80 V 開始電泳,待Marker 各條帶明顯分離后,調節電壓至120 V 繼續電泳,至上樣緩沖液距分離膠底部約0.5 cm 處,停止電泳。③轉膜。剪取合適大小的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜,酒精浸泡10 s,然后置于轉膜液中,濕轉,恒壓100 V,轉印60 min。④封閉。PVDF 膜完全浸入4%BSA封閉液中,室溫,在搖床上封閉90 min 后,TBST緩沖液洗滌3 次,每次5 min。⑤雜交。將PVDF膜裁剪成合適大小放入雜交盒中,加入第一抗體,4℃過夜,再加入第二抗體,室溫搖床上雜交1 h,TBST 緩沖液洗滌3 次,每次5 min。⑥顯影。將PVDF 膜逐一浸潤顯影液,上機檢測顯影。通過觀察條帶灰度,判斷HBO1 在結腸癌組織以及與之匹配癌旁正常結腸組織中的表達情況。

1.5 統計學方法

通過SPSS 25.0 計算機軟件進行數據統計學分析,計量資料以均數±標準差（）表示；計數資料以百分率（%）表示,比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBO1 蛋白在結腸癌組織中的表達情況

HBO1 蛋白產物出現在75 kDa 處,以GAPDH作為內參對照,HBO1 在結腸癌組織（C）中的表達明顯高于在癌旁正常結腸組織（N）中的表達。見圖1。

圖1 HBO1 在結腸癌組織及正常結腸組織中的表達情況

2.2 HBO1 表達與結腸癌患者臨床病理參數之間的關系

根據Western blot 的實驗結果,HBO1 的表達情況與腫瘤分化程度,TNM 分期,淋巴結轉移情況及腫瘤大小有關,差異有統計學意義（P＜0.05）。與患者的性別,年齡無顯著相關性,差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 HBO1 表達與結腸癌患者臨床病理參數的關系（例）

3 討論

結直腸癌（CRC）是全球癌癥死亡的主要原因之一。早期CRC 患者（TNM Ⅰ～Ⅱ期）的5 年生存率在70%～90%之間,而晚期患者（TNM Ⅲ～Ⅳ期）的5 年生存率急劇下降至10%～60%,說明了早期發現的重要性。包括APC、KRAS 和TP53突變在內的多種遺傳變化,以及SMAD2 和SMAD4 活性的缺失促進了CRC 的發生［1］。結腸癌的治療方式目前仍以手術為主,其他治療為輔。結腸癌的早發現、早診斷、早治療對于患者的預后尤為重要,更為敏感的腫瘤檢測指標的發現可以為結腸癌患者帶來福音。

有研究表明,癌基因可以促使正常的結腸細胞發生異常增殖。HBO1 作為組蛋白乙酰轉移酶MYST 家族中的重要一員,位于人類17 號染色體長臂2 區1 帶第3 亞帶區域（17q21.3）,是組蛋白特異的乙酰轉移酶,在組蛋白乙酰轉移酶結合至起始識別復合物1（ORC1）上首次被發現。HBO1具有廣譜的乙酰轉移酶的生物活性,主要參與染色體的結構調控,H3 和H4 等組蛋白的乙?；?；HBO1 可以和 ORC1、ORC2、MCM2、CDC6、ING4、ING5 等因子相互作用,從而參與細胞復制以及轉錄的調節工作,進而對細胞的周期產生一定程度的調控作用。在DNA 復制方面,HBO1 可以通過這兩種方式參與其中,一是通過乙?；疕4K5/8/12 來促進復制前復合物的形成,二是乙?；疕3K14 來促進CDC45 的裝載以激活S 期時的DNA 的復制。而在基因的轉錄激活的過程中,HBO1 可以通過與基因編碼區和轉錄起始的位點的結合,從而與ING4/5、hEaf6 和JADE1/2/3 形成復合物,在染色質的基因編碼區通過復合物中的多個鋅指結構與組蛋白H3 尾相互作用,通過ING4/5和JADE 等調控轉錄的起始及周期［2］。目前已經有很多的研究表明,HBO1 表達的增強是很多惡性腫瘤發生以及發展的促進因素。QUINTELA 等［3］的研究發現,HBO1 復合物在卵巢癌中過表達,HBO1 介導組蛋白H4 特異性乙酰化,增強卵巢癌細胞的機制轉導途徑和膜彈性,從而誘發卵巢細胞癌變及增強癌細胞的浸潤性。HAYASHI 等［4］的研究證明新發現的慢性粒單核細胞白血病（CMML）融合蛋白-98（NUP98）-HBO1 的異常組蛋白乙酰化反應,足以產生臨床相關的CMML 發病機制,進而誘發CMML。王燕等［5］的研究發現,HBO1 在肝癌患者的癌細胞中呈現出過表達狀態,促進了肝癌細胞的增殖,增強了肝癌的侵襲性以及轉移能力。王文忠［6］研究發現HBO1 在乳腺癌組織中過表達,并且和類固醇雌激素受體α 和孕激素受體的表達呈現正相關,雌二醇通過ERK1/2通路促進HBO1 的表達。同時,甘詩泉［7］研究發現HBO1 在宮頸癌細胞和癌組織中呈現高表達。這些研究成果均表明,HBO1 的過度表達與多種腫瘤的發生、發展密切相關。

本實驗研究結果證實,HBO1 在結腸癌組織中表達極其豐富,而在癌旁正常結腸組織中呈現出低表達或者無表達狀態,通過統計學分析,筆者發現HBO1 的表達情況與結腸癌的腫瘤分化程度,TNM 分期,淋巴結轉移情況及腫瘤大小具有相關性,而與患者的性別,年齡無顯著相關性。表明HBO1 對于結腸癌的發生及發展具有促進作用,并與腫瘤的侵襲及轉移密切相關。然而,目前關于HBO1 的致癌機理,研究得仍不是很明確,有待進一步做深入研究。

綜上所述,將來HBO1 很有可能成為一種結腸癌的腫瘤檢測指標,指導癌癥早期的發現,或者作為癌癥治療時的靶向藥物的作用靶點,從而使更多的結腸癌患者的病情得到有效的治療。