海南島不同林齡短枝木麻黃凋落物內外真菌多樣性分析

左林芝,黃 蕊,張雅倩,陳 盼,李 蕾

海南師范大學生命科學學院/教育部熱帶島嶼生態學重點實驗室,?？?571158

凋落物是森林系統中重要的組成部分,凋落物的降解是林地土壤養分的重要來源。大量文獻已表明,凋落物表面附著的微生物及其內生菌則對凋落物的降解具有重要作用[1- 2]。另外,凋落物表面附著的微生物及其內生菌與植物次生產物代謝密切相關,林地土壤微生物受趨化作用在凋落物表面聚集[3],進而影響凋落物的降解及其產物合成,內生菌則直接以聯合代謝的方式參與植物次生代謝產物的合成[4]。

海南島海防林是由短枝木麻黃(CasuarinaequisetifoliaL.)單一樹種構成的純林,林下凋落物主要是木麻黃衰老死亡的枯枝。關于木麻黃凋落物的研究表明,木麻黃凋落物分解緩慢,對林地養分的貢獻較小[5]；而凋落物中的次生代謝產物則可通過淋溶等途徑進入土壤,并在土壤中積累,通過化感作用,抑制了自身種子或其他植物種子的萌發和幼苗生長[6- 8]。

目前關于木麻黃微生物的研究主要集中于木麻黃林地土壤微生物、植株內生真菌的傳統分離、鑒定及其化感作用等方面[9-12],對凋落物微生物的組成及其群落演替特征則較少涉及,而此研究對于探討木麻黃林地微生物在凋落物的降解、化感物質積累等方面的生態功能具有重要作用。因此,本研究通過Illumina Miseq高通量測序法分析不同林齡木麻黃凋落物內外真菌的多樣性變化,比較不同林齡木麻黃凋落物內外真菌群落結構的差異,為探討微生物在木麻黃凋落物降解過程和次生產物代謝中的作用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

以海南省海口市桂林洋開發區濱海的短枝木麻黃林為研究對象,該地(20.02°N,110.52°E)屬熱帶海洋季風氣候,日照時間長,熱量豐富,年平均氣溫23.8℃。年降水量1500—2000 mm,平均相對濕度約85%,干、濕兩季分明,5—10月為多雨季。常年以東風和東北風為主,年平均風速為3.4 m/s,6—10月為臺風頻發期[13]。

1.2 樣品采集與預處理

2016年10月到研究樣地的幼齡林(林齡5—8年)、中齡林(林齡15—20年)和成熟林(林齡30年及以上)中,以“S型取樣法”選取15個樣點,采集5—15 cm厚度的木麻黃凋落物及林地土壤。將樣品充分混勻后裝入無菌袋,用冰盒帶回實驗室并置于-80℃冰箱中保存。收集并混勻洗滌凋落物后的無菌水檢測其外生真菌；用75%乙醇(1 min)、20% NaClO(10 min)和無菌水表面滅菌后檢測凋落物內生真菌[14]。

1.3 凋落物內外真菌測序

取適量預處理后的樣品,提取宏基因組DNA,采用真菌ITS區域作為目標DNA序列,以通用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA- 3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC- 3′)進行PCR擴增并純化,進行熒光定量及Miseq文庫構建后利用Illumina Miseq PE300平臺測序,測序工作由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.4 凋落物和土壤樣品理化性質測定

將凋落物和土壤樣品風干,研磨后過1mm的篩,混勻備用。參照《土壤理化分析實驗指導》、《土壤分析技術規范》分析木麻黃凋落物和林地土壤理化性質[15-16]。采用烘干法測定樣品含水率(WC)(GB 7833—1987)；電位測定法測定pH值(土液比1∶2.5)(GB 7859—1987)；凱氏定氮法測定全氮(TN)(GB 7173—1987)；KCl浸提-比色法測定銨態氮(AN)；酚二磺酸-比色法測定硝態氮(NN)；NaOH熔融-鉬銻抗比色法測定全磷(TP)(GB 7852—1987)；環刀法測定容重(BD)(GB 7844—1987)；重鉻酸鉀-消化爐加熱法測定有機質(OM)(GB 7857—1987)。

1.5 數據處理與分析

根據overlap關系對Miseq測序得到的PE reads進行拼接,同時對序列質量進行質控和過濾,根據不同的相似度水平對所有序列進行OTU劃分,對97%相似水平下的OTU進行生物信息統計分析。利用Mothur軟件 (version v.1.30.1 http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity)計算凋落物內外真菌Alpha多樣性(Shannon指數、Simpson指數和Chao1指數),分析真菌群落的多樣性和豐富度[17- 19]。運用R程序和Mothur進行OTUs的維恩(Venn)分析,統計內外真菌共有和特有OTU數。基于tax_summary_a文件夾中的數據表,利用R語言工具作真菌群落柱形圖,統計各樣本在各分類水平上含有的真菌種類及比例。使用R v.2.15.2(統計計算的R基礎2)和純素包(2.0- 7版)生成真菌的分類分布熱圖。利用LEfSe軟件(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?tool_id=lefse_upload)根據分類學組成進行線性判別分析(LDA),找出對樣本差異具有顯著影響的菌群。采用QIIME (Quantitative Insights to microecology)軟件包1.9.1(Caporaso,J.G.,et al,2010)進行主坐標分析(PCoA)。使用軟件Canoco for Windows 4.5作RDA/CCA圖,分析凋落物真菌群落組成與環境因子的關系。

2 結果與分析

2.1 凋落物真菌群落多樣性與組成分析

2.1.1凋落物內外真菌多樣性

3林齡木麻黃凋落物的18個樣品經測序得到669,476條有效序列,其中凋落物內生真菌分屬于6門23綱56目108科177屬255種,外生真菌分屬于5門21綱55目114科198屬293種。所有樣品的文庫覆蓋率均在99.6%以上,說明測序條數足以覆蓋凋落物樣品中絕大部分微生物,能夠反映絕大多數真菌信息(表1)。由Shannon指數、Simpson指數和Chao1指數看,木麻黃凋落物外生真菌的多樣性和豐富度高于內生真菌。由3林齡的Chao1指數可看出,中齡林的豐富度高于幼齡林,成熟林最低。

表1 不同林齡木麻黃凋落物內外真菌多樣性指數表

YDI：幼齡林凋落物內生真菌,endophytic fungal communities of the litter in the young-aged forest；MDI：中齡林凋落物內生真菌,endophytic fungal communities of the litter in the middle-aged forest；ADI：成熟林凋落物內生真菌,endophytic fungal communities of the litter in the mature-aged forest；YDE：幼齡林凋落物外生真菌,epiphytic fungal communities of the litter in the young-aged forest；MDE：中齡林凋落物外生真菌,epiphytic fungal communities of the litter in the middle-aged forest；ADE：成熟林凋落物外生真菌,epiphytic fungal communities of the litter in the mature-aged forest；同一列中不同字母表示差異顯著(P≤0.05)

2.1.2凋落物內外真菌的OTUs分析

對97%相似水平下的OUT進行Venn圖分析發現(圖1),木麻黃凋落物內生真菌OTUs總數為644,外生真菌為841,其中,555個OTUs為凋落物內、外真菌共有,分別占內、外真菌總數的86.18%、65.99%,表明大多內生真菌可能與外生真菌具有相同來源。從林齡上看,3林齡的共有OTUs數均遠多于特有OTUs,表明凋落物內、外真菌群落差異由少數菌群決定,而特有的內生真菌則可能由種子來源[20-21]。

圖1 不同林齡木麻黃凋落物內外真菌Venn圖Fig.1 Venn diagram of endophytic and epiphytic fungi of C. equisetifolia litter at different ages YDI：幼齡林凋落物內生真菌,endophytic fungal communities of the litter in the young-aged forest；MDI：中齡林凋落物內生真菌,endophytic fungal communities of the litter in the middle-aged forest；ADI：成熟林凋落物內生真菌,endophytic fungal communities of the litter in the mature-aged forest；YDE：幼齡林凋落物外生真菌,epiphytic fungal communities of the litter in the young-aged forest；MDE：中齡林凋落物外生真菌,epiphytic fungal communities of the litter in the middle-aged forest；ADE：成熟林凋落物外生真菌,epiphytic fungal communities of the litter in the mature-aged forest

2.1.3凋落物內外真菌群落組成

不同林齡木麻黃凋落物真菌由6個門組成(圖2),擔子菌門(Basidiomycota)和子囊菌門(Ascomycota)在內生真菌中比例較高,分別占44.19%、43.78%；子囊菌門在外生真菌中比例最高(占74.63%),尤其在幼林齡外生真菌中占優勢。隨著林齡的增加,子囊菌門在內外真菌中所占比例呈先減后增的趨勢,擔子菌門則相反。

在目分類水平上,3林齡凋落物內生真菌共56目,外生真菌共55目,其中7個目為分類不明確目(圖2)。煤炱目(Capnodiales)和炭角菌目(Xylariales)為內、外真菌共同優勢目,糙孢孔目(Trechisporales)為內生真菌最優勢目,格孢腔菌目(Pleosporales)為外生真菌最優勢目。另外,隨著林齡的增加,內生真菌群落均勻度先降低后升高,外生真菌則相反。

結果還表明,Rozellomycota為內生真菌特有菌門,且僅分布于中林齡凋落物內部。從目水平看,Coniochaetales、Magnaporthales、未分類壺菌門和未分類Rozellomycota等4個目始終定殖于凋落物內部,而蛙糞霉目(Basidiobolales)、絲孢酵母目(Trichosporonales)和未命名傘菌綱始終附生于凋落物外部。

圖2 不同林齡木麻黃凋落物內外真菌在不同分類水平中的群落結構Fig.2 Community structure of fungi of C. equisetifolia litter at different classification levels

2.1.4凋落物內外真菌PCoA分析

主坐標(PCoA)分析顯示不同樣本中97%相似性OTU的組成,反映木麻黃凋落物內外真菌群落組成的相似性和差異性。本研究中PC1、PC2是造成樣品差異的兩個最大差異性特征,累計解釋了35.99%的真菌群落變化(圖3)。整體上看,凋落物外生真菌群落分布較內生真菌集中,兩者分布區域有部分重疊,表明內、外真菌群落結構存在一定共性。幼、中林齡真菌群落結構的分布區域有較大重疊,表明兩者的真菌群落組成較相似。大多數成熟林樣本在PC2軸上與幼、中林齡較遠,表明該林齡真菌群落組成與其他林齡有較大差異。

圖3 不同林齡木麻黃凋落物內外真菌主坐標分析Fig.3 Principal co-ordinates analysis (PCoA) for endophytic and epiphytic fungal communities of the litter in differently aged C. equisetifolia forestsDEF：凋落物外生真菌,epiphytic fungal communities of the litter；DIF：凋落物內生真菌,endophytic fungal communities of the litter；ADF：成熟林凋落物真菌,fungal communities of the litter in the mature-aged forest；MDF：中齡林凋落物真菌,fungal communities of the litter in the middle-aged forest；YDF：幼齡林凋落物真菌,fungal communities of the litter in the young-aged forest

2.2 真菌群落差異分析

2.2.1凋落物內外真菌物種豐度分析

選取豐度排名前10的3林齡凋落物內外真菌目,對樣本間的相對豐度進行聚類分析后得Heatmap圖(圖4)。糙孢孔目和未分類傘菌綱在內生真菌中的豐度顯著高于外生真菌,煤炱目則相反。從林齡上看,未分類傘菌綱在中林齡凋落物內部顯著富集,而外部豐度極低。糙孢孔目主要聚集在幼、中林齡凋落物內部。傘菌目(Agaricales)在幼、中林齡凋落物內部的豐度高于外部,成熟林則相反。相反地,木耳目(Auriculariales)在幼、中林齡凋落物內的豐度低于外部,成熟林相反。

圖4 不同林齡木麻黃凋落物真菌在目水平上的物種豐度熱圖Fig.4 Heat maps of species abundance of endophytic and epiphytic fungi in differently aged C. equisetifolia forests at the order level

2.2.2凋落物內外真菌LEfSe分析

通過LEfSe分析(LDA閾值為4)發現,對3林齡間差異有顯著影響的內生真菌有：幼林齡糙孢孔目、中林齡低孔菌科(Hyponectriaceae)(從科到屬)和成熟林肉杯菌科(Sarcoscyphaceae)(從科到屬)。對3林齡間差異有顯著影響的外生真菌有：幼林齡的叢赤殼屬(Nectria)、球腔菌科(Mycosphaerellaceae)和成熟林的扁孔腔菌科(Lophiostomataceae)(從科到屬)(圖5)。由物種豐度分析發現,以上所述糙孢孔目和煤炱目的球腔菌科屬于木麻黃凋落物真菌群落優勢物種。

圖5 不同林齡木麻黃凋落物內外真菌LEfSe分析Fig.5 LDA Effect Size analysis (LEfSe) of endophytic and epiphytic fungal communities of the litter in differently aged C. equisetifolia forests

2.3 凋落物內外真菌與凋落物、土壤理化性質的RDA/CCA分析

研究分析了木麻黃凋落物內外真菌群落結構與凋落物、林地土壤含水率(WC)、pH值、全氮(TN)、銨態氮(AN)、硝態氮(NN)、全磷(TP)、有機碳(OC)、容重(BD)、全鉀(TK)、有機質(OM)等理化性質的相關性。結果表明,木麻黃凋落物內生真菌群落結構與凋落物pH值和有機碳有顯著相關性,與土壤理化因子關系不顯著；而外生真菌群落結構與土壤容重和銨態氮有顯著相關性,與凋落物理化性質關系不顯著(圖6)。

在內外真菌共同的優勢目中,煤炱目與凋落物pH、全磷、全氮及土壤含水率相關；炭角菌目與凋落物pH和土壤全磷相關性較大；木耳目與凋落物pH、土壤銨態氮和容重相關性較大。傘菌目、糙孢孔目等內生真菌特有優勢目中,前者與凋落物全磷相關性較大,后者與凋落物含水率相關性較大。格孢腔菌目、肉座菌目(Hypocreales)等外生真菌優勢目中,格孢腔菌目與土壤pH相關性較大,肉座菌目與凋落物全氮相關性較大(圖7)。

圖6 真菌群落與凋落物及土壤理化性質的相關性分析Fig.6 RedundancyAnalysis (RDA)/Canonical Correspondence Analysis (CCA) between fungal communities and the physicochemical property of the forest litter and soil pH：pH值；AN：銨態氮；NN：硝態氮；TN：全氮；TP：全磷；WC：含水率； OC：有機碳；BD：容重；TK：全鉀；OM：有機質。黑色倒三角和黑色箭頭表示高豐度類群

圖7 優勢真菌群落與凋落物及土壤理化性質的RDA分析Fig.7 RDA analysis between dominant fungal communities and the physicochemical property of the forest litter and soil

3 結論與討論

3.1 凋落物內外真菌群落組成

凋落物真菌多樣性分析表明,不同林齡木麻黃凋落物外生真菌多樣性和豐富度高于內生真菌,這與Gang等的研究結果“植物根際真菌群落的多樣性高于根內生真菌”相似[22]。凋落物內、外真菌共有物種數目占較大比例,說明木麻黃凋落物內、外真菌群落組成有較大共性,說明外生真菌群落來源部分由于菌群的趨化作用而聚集外[3],大部分可能來源于凋落物的降解。分析結果顯示,蛙糞霉目等3個目始終附生于凋落物外部,Coniochaetales 等4個目始終定殖于凋落物內部,這些內生真菌特有種可能來源于木麻黃種子或空氣環境[20-21,23],外生真菌特有種則可能是在凋落物降解過程中林地土壤真菌不斷向其轉移的結果。

不同林齡間,凋落物內外真菌群落組成大多與木麻黃林齡無顯著相關性,可能表明木麻黃枝葉作為凋落物脫離母體后,植株對真菌的影響逐漸減弱,而受所處環境的影響逐漸增加。藍麗英等和徐璇等的研究表明,在凋落物分解過程中,土壤動物以選擇性牧食作用來調控微生物種群數量,其排泄物還可刺激微生物生長[24-25]。

3.2 凋落物內外真菌優勢物種

分析3林齡木麻黃凋落物內外真菌群落的相似性和差異性發現,子囊菌門和擔子菌門為最優勢門,在目水平上,煤炱目、炭角菌目和木耳目為凋落物內、外真菌共同優勢目。據文獻報道,子囊菌門和擔子菌門在蘭科[26]、鐵皮石斛[27]和楊樹[28]等多種植物中為主導菌門,煤炱目、炭角菌目是植物中較為普遍的內生真菌[29-30],與我們的研究結果一致。

前人研究還顯示,子囊菌門大多菌群可分解新鮮植物殘體[31],我們研究中,子囊菌門的格孢腔菌目、肉座菌目等為凋落物外生真菌的優勢菌群,表明這些外生真菌優勢物種可能在凋落物降解過程中起重要作用。

3.3 凋落物內外真菌群落與環境因子的關系

RDA/CCA分析結果表明,凋落物內生真菌群落結構受凋落物pH值和有機碳顯著影響,而凋落物外生真菌群落結構則與土壤容重和銨態氮顯著相關。說明宿主植物養分是內生真菌群落組成的主要決定因素,而附著于凋落物表面真菌的生長則主要依賴土壤提供的養分。

前人的研究也表明,pH和有機質對真菌群落組成具有重要影響[32-33],另外,總磷的增加導致真菌群落多樣性降低[34]。本研究發現與幼、中林齡相比,成熟林土壤全磷含量最高,而該林齡凋落物內外真菌多樣性及豐富度均最低,表明較高的磷含量不利于真菌群落的生長。另外,中林齡凋落物真菌群落較幼、成林高,該林土壤有機質、硝態氮、銨態氮較幼、成林高,課題組前期的研究表明,中林土壤微生態環境適合植株生長[35],真菌群落在其中發揮著重要作用。