基于環(huán)境DNA技術(shù)的遼東灣真核微藻群落結(jié)構(gòu)特征

宋 倫,吳 景,宋廣軍,董少杰,王志松

1 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院,遼寧省海洋生物資源與生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大連 116023 2 天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300384

遼東灣是中國(guó)渤海最大的半封閉式海灣,是海洋生物重要的索餌場(chǎng)、產(chǎn)卵場(chǎng)、越冬場(chǎng)和洄游通道,但多年來超負(fù)荷承載陸源污染,近岸海域富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重,赤潮、褐潮頻發(fā)[1- 2]。微微型微藻(0.22—2 μm)在海洋中多樣性相當(dāng)豐富,也是褐潮暴發(fā)的主要致災(zāi)種,由于個(gè)體微小、形態(tài)學(xué)鑒定困難一度研究較為遲緩[3]。遼東灣西南側(cè)海域從2009年開始至今每年都暴發(fā)抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)褐潮[4],最大面積達(dá)3400 km2,褐潮期間養(yǎng)殖貝類滯長(zhǎng)、部分死亡,生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞,旅游業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失巨大。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展極大地推動(dòng)了微型藻類的高效檢測(cè)研究[5],借助該技術(shù),2014—2015年宋倫等在遼東灣長(zhǎng)興島海域又發(fā)現(xiàn)了尚未報(bào)道的微擬球藻(Nannochlorissp.)和金牛微球藻(Ostreococcustauri)褐潮致災(zāi)種[6]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了褐潮致災(zāi)種抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)和外來有害微藻Stoeckeriaalgicida在遼東灣的擴(kuò)散跡象[7- 8]。

另一方面,目前遼東灣微藻只記錄了95種[9],海洋微藻多樣性研究相對(duì)比較薄弱,鑒于此,該研究采用高通量測(cè)序平臺(tái),結(jié)合生物信息學(xué)方法,以18S rDNA的V4區(qū)為目標(biāo)基因?qū)|東灣海域的真核微藻進(jìn)行多樣性檢測(cè),分析其群落結(jié)構(gòu)特征,探尋新種類,為外來海洋微藻研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

圖1 遼東灣采樣站位示意Fig.1 Sampling sites in Liaodong Bay

為了解真核微藻群落結(jié)構(gòu)特征,在遼東灣海域網(wǎng)格化設(shè)置12個(gè)站位(圖1),分別于2014年5月(春)、8月(夏)、10月(秋)、12月(冬)采集表層海水1L,樣品首先經(jīng)200 μm篩絹過濾去除大型浮游生物,然后用0.22 μm微孔濾膜過濾收集真核微藻,最后將濾膜轉(zhuǎn)移至1.5 mL無菌離心管中,置于-20或-80℃冷凍保存、運(yùn)輸。

1.2 分析方法

1.2.1基因組 DNA 的提取

采用CTAB法提取真核微藻宏基因組,具體參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]。

1.2.218S rDNA可變區(qū)V4的PCR擴(kuò)增

利用自行開發(fā)的真核微藻18S rDNA的V4區(qū)基因擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,具體步驟參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]。

1.2.3數(shù)據(jù)分析

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)使用FLASH軟件進(jìn)行拼接,參照Qiime軟件質(zhì)量控制流程將拼接后的序列經(jīng)過截取、過濾得到有效數(shù)據(jù)。利用Uparse對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行可操作分類單元(OTUs)聚類和物種分類,采用RDP Classifier方法與SILVA數(shù)據(jù)庫對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋[10]。

采用Shannon-Wiener指數(shù)(H′)統(tǒng)計(jì)物種多樣性水平：

式中,Pi為第i種真核微藻的OTUs數(shù)與樣本總OTUs數(shù)的比值；S為種類數(shù)。

物種優(yōu)勢(shì)度(Y)表示真核微藻群落中某一物種所占的優(yōu)勢(shì)程度：

式中,nx為第x種真核微藻種類的OTUs數(shù),N為OTUs總數(shù),fx為第x種真核微藻種類在各樣品中出現(xiàn)的頻率。

公式計(jì)算、數(shù)據(jù)分析、方差檢驗(yàn)、圖件繪制均通過Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0、PRIMER 5.0軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量

測(cè)序所得有效數(shù)據(jù)每個(gè)樣品平均獲得77297條原始序列,經(jīng)過拼接和質(zhì)量過濾,每個(gè)樣品平均得到70604 條序列,高質(zhì)量數(shù)據(jù)占到91%以上,表明測(cè)得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。各樣品測(cè)序結(jié)果見表1。

2.2 OTUs聚類和物種注釋

為進(jìn)一步分析表層海水樣品中物種組成多樣性信息,使用Uparse軟件對(duì)所有樣品的有效序列進(jìn)行聚類分析,以97%的一致性將序列聚類成為OTUs種水平,每個(gè)樣品平均獲得378個(gè)OTUs,春、夏、秋、冬分別注釋微藻150、187、183、195。

2.3 微藻組成及相對(duì)豐度

2.3.1綱水平微藻種類組成及相對(duì)豐度

2014年春季(5月)遼東灣各個(gè)樣品中甲藻綱(Dinophyceae)獲得注釋的物種數(shù)量約占總數(shù)的43%,高于其他綱。調(diào)查海域的微藻多樣性甲藻綱為優(yōu)勢(shì)群體,而綠枝藻綱(Prasinophyceae)、隱藻綱(Cryptophyceae)、中心綱(Centricae)獲得注釋的物種數(shù)量均為10%左右,以上五個(gè)綱約占整個(gè)微藻的70%。真眼點(diǎn)藻綱(Eustigmatophyceae)只存在于3、9、12站位(圖2)。

圖2 春季(5月)遼東灣微藻中主要類群綱水平多樣性Fig.2 Class level diversity of major taxa in microalgae in spring of Liaodong Bay

調(diào)查海域中,不同綱的相對(duì)豐度相差非常大,同一綱在不同站位的相對(duì)豐度變化很大。2014年春季,甲藻綱相對(duì)豐度最高,平均豐度為0.57。其次是綠枝藻綱、隱藻綱、浮生藻綱(Pelagophyceae),相對(duì)豐度平均值分別為0.14、0.10、0.10。應(yīng)該引起注意的是4、7、8站位中浮生藻綱的相對(duì)豐度顯著高于其他站位,其OTUs注釋結(jié)果為抑食金球藻,是引發(fā)褐潮的一種微微型藻類(圖3)。

圖3 春季(5月)遼東灣微藻中主要類群相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of major taxa for all eukaryotic phytoplankton in spring

2014年夏季(8月)遼東灣海域各個(gè)站位的微藻在綱的分類水平上,主要類群多樣性在各站位之間變化較小。各個(gè)樣品中甲藻綱獲得注釋的物種數(shù)量約占總數(shù)的39%,高于其他綱,而綠枝藻綱、隱藻綱、中心綱獲得注釋的物種數(shù)量均為10%左右,以上3個(gè)綱約占整個(gè)微藻的70%。真眼點(diǎn)藻綱的分布相對(duì)5月份有所增加,4、8、9、10、11、12站均出現(xiàn)(圖4)。

圖4 夏季(8月)遼東灣微藻中主要類群綱水平多樣性Fig.4 OTUs richness of major taxa for all eukaryotic phytoplankton in summer

2014年夏季,甲藻綱的相對(duì)豐度范圍0.19—0.76,平均值為0.54；綠枝藻綱、共球藻綱、隱藻綱、中心綱相對(duì)豐度平均值分別為0.11、0.08、0.09、0.08。巴夫藻綱(Pavlovophyceae)在5、6、7的相對(duì)豐度分別為0.06、0.04、0.09,顯著高于其他站位(圖5)。

圖5 夏季(8月)遼東灣微藻中主要類群相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of major taxa for all eukaryotic phytoplankton in summer

2014年秋季(10月),各個(gè)樣品中甲藻綱(Dinophyceae)獲得注釋的物種數(shù)量約占總數(shù)的44%,高于其他綱。調(diào)查海域的微藻多樣性甲藻綱為優(yōu)勢(shì)群體,而中心綱獲得注釋的物種數(shù)量均為14%左右,其他綱均低于10%。真眼點(diǎn)藻綱在2、4、5、8、12站位出現(xiàn)極少量OTUs(圖6)。

圖6 秋季(10月)遼東灣微藻中主要類群綱水平多樣性Fig.6 OTUs richness of major taxa for all eukaryotic phytoplankton in autumn

2014年秋季,其基礎(chǔ)組成與OTUs相對(duì)應(yīng),但部分綱水平相較春季和夏季的相對(duì)豐度有所增加。甲藻綱的平均相對(duì)豐度為0.65,高于其他綱。調(diào)查海域的微藻多樣性甲藻綱為優(yōu)勢(shì)群體,而綠枝藻綱、隱藻綱的平均相對(duì)豐度分別為0.13、0.11,以上三個(gè)綱約占整個(gè)微藻的89%(圖7)。

圖7 秋季(10月)遼東灣微藻中主要類群相對(duì)豐度Fig.7 Relative abundance of major taxa for all eukaryotic phytoplankton in autumn

2014年冬季(12月),甲藻綱獲得注釋的物種數(shù)量約占總數(shù)的41%,高于其他綱。調(diào)查海域的微藻多樣性甲藻綱為優(yōu)勢(shì)群體,而綠枝藻綱、隱藻綱、定鞭金藻綱(Prymnesiophyceae)、中心綱獲得注釋的物種數(shù)量均為10%左右,以上5個(gè)綱約占整個(gè)微藻的78%(圖8)。

圖8 冬季(12月)遼東灣微藻中主要類群綱水平多樣性Fig.8 OTUs richness of major taxa for all eukaryotic phytoplankton in winter

2014年冬季,部分甲藻綱的平均相對(duì)豐度為0.55,為優(yōu)勢(shì)群體,而綠枝藻綱、隱藻綱的平均相對(duì)豐度分別為0.13、0.15,以上3個(gè)綱約占整個(gè)微藻的83%,明顯高于其他綱。金藻綱(Chrysophyceae)在9、12站位顯著高于其他站位和季節(jié)(圖9)。

圖9 冬季(12月)遼東灣微藻中主要類群相對(duì)豐度Fig.9 Relative abundance of major taxa for all eukaryotic phytoplankton in winter

2.3.2種水平微藻種類組成及相對(duì)豐度

四季共注釋到種的微藻有136種(附表1),其中甲藻門(Dinoflagellata) 44種,綠藻門(Chlorophyta)17種,隱藻門(Cryptophyceae)12種,定鞭藻門(Haptophyta)18種,硅藻門(Bacillariophyceae)37種,金藻門(Chrysophyceae)6種,黃藻門(Xanthophyceae)2種。另有大部分藻類由于數(shù)據(jù)庫沒有序列信息而未能注釋到種,主要由于部分藻類采集培養(yǎng)困難而無法獲得鑒定信息。

2.3.3檢出的藻類新種

遼東灣海域注釋到種的136種真核微藻中,對(duì)比《中國(guó)海洋生物名錄》[11]和《遼東灣微藻生態(tài)特征研究》[9],并查閱最新相關(guān)文獻(xiàn)[12],發(fā)現(xiàn)有30種未在遼東灣海域報(bào)道過但在中國(guó)其他海域有報(bào)道,包括甲藻門11種、硅藻門9種、綠藻門4種、定鞭藻門2種、隱藻門2種、金藻門2種。另有56種在中國(guó)海域未見過報(bào)道,包括甲藻門15種、硅藻門8種、綠藻門9種、定鞭藻門12種、隱藻門8種、金藻門3種、黃藻門1種(附表1)。

圖10 遼東灣近岸、遠(yuǎn)岸多樣性指數(shù)Fig.10 Inshore and far-shore diversity index of Liaodong Bay

2.3.4營(yíng)養(yǎng)和共生模式

通過對(duì)鑒定出的藻類營(yíng)養(yǎng)模式統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)81種自養(yǎng)型、14種異養(yǎng)型、41種混合營(yíng)養(yǎng)型藻類。除以上的營(yíng)養(yǎng)模式之外,共生生態(tài)模式也出現(xiàn)在調(diào)查結(jié)果中,寄生性甲藻共甲藻目的OTUs數(shù)目占總數(shù)20%,因數(shù)據(jù)庫收錄信息較少,絕大多數(shù)沒有獲得種水平的注釋信息,發(fā)現(xiàn)的寄生性藻類杜波斯克屬(Euduboscquellacachoni、Euduboscquellacrenulata)和渦輪共甲藻(Syndiniumturbo)為罕見藻類,因此遼東灣海域寄生性藻類的多樣性尚需深入研究。光合共生甲藻五刺多甲藻在本次調(diào)查中也檢測(cè)出其與硅藻共生,有研究表示光營(yíng)養(yǎng)的鰭藻屬起源于隱藻屬的葉綠體,本次檢出兩種鰭藻[13]。

2.3.5多樣性評(píng)價(jià)

多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明,遼東灣海域微藻多樣性指數(shù)春、夏、秋、冬總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì),春季(5月)和夏季(8月)波動(dòng)較大,而秋季(10月)和冬季(12月)相對(duì)穩(wěn)定,且多樣性水平較高。多樣性指數(shù)在春、秋季近岸高于離岸海域,在夏、冬季離岸高于近岸海域(圖10)。全年來看,多樣性指數(shù)波動(dòng)較大的站位為1、3、6、7、8、12號(hào)(圖11)。

圖11 遼東灣各站位多樣性指數(shù)Fig.11 Diversity index of each station in Liaodong Bay

2.3.6優(yōu)勢(shì)種統(tǒng)計(jì)

本文統(tǒng)計(jì)了遼東灣海域不同季節(jié)優(yōu)勢(shì)度大于0.02的微藻(注釋到目、科、屬、種的全部統(tǒng)計(jì),表2)。其中共甲藻目Syndiniales 2優(yōu)勢(shì)度最高,春季達(dá)到了0.34,秋季達(dá)到了0.13,為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種；其次為夜光藻(Noctilucascintillans),春、夏、秋、冬均為主要優(yōu)勢(shì)種,冬季優(yōu)勢(shì)度達(dá)到了0.10,成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種,而且其細(xì)胞較大,在水體中所占體積也較大。另外在四個(gè)季節(jié)均為優(yōu)勢(shì)種的還有葡萄藻屬(Bathycoccussp.)、細(xì)小微胞藻(Micromonaspusilla)、微擬球藻(Nannochlorissp.)、纖細(xì)全溝藻(Teleaulaxgracilis)。褐潮致災(zāi)種抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)在春季優(yōu)勢(shì)度非常明顯。

春、夏季已知有毒優(yōu)勢(shì)種類為凱倫藻屬(Kareniaceaesp.)、黃金色鞭毛藻(Poterioochromonasmalhamensis)、魚腥棕囊藻(Phaeocystiscordata)、抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)(部分注釋到目、科的無法查詢毒性)。

表2 遼東灣海域微藻優(yōu)勢(shì)種統(tǒng)計(jì)表

3 討論

3.1 基因測(cè)序獲得的藻類新種

基因測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展突破了微微型微藻傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定局限,提高了調(diào)查靈敏度、準(zhǔn)確度和檢測(cè)效率。遼東灣海域注釋到種的真核微藻有136種,有41%的種類在中國(guó)海域未見報(bào)道,甲藻門和定鞭藻門居多。不可否認(rèn),新發(fā)現(xiàn)的藻類也可能是本海域土著種。另外,前期網(wǎng)采調(diào)查發(fā)現(xiàn)本海域微藻共有95種[9],本次基因檢測(cè)的136種并未全部涵蓋前期發(fā)現(xiàn)的種類,主要原因可能是由于某些種類很難培養(yǎng),基因序列無法獲得,造成18s rDNA微藻數(shù)據(jù)庫種類不全,注釋到種的成功率較低。

3.2 微藻群落結(jié)構(gòu)特征

早期研究認(rèn)為微藻都是光合自養(yǎng)生物,具有類似的生態(tài)需求,按生態(tài)學(xué)競(jìng)爭(zhēng)排斥原理,它們對(duì)水體資源,特別是對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng),最終應(yīng)僅剩下一個(gè)或幾個(gè)最能有效地利用有限資源的種類。與競(jìng)爭(zhēng)排斥理論相悖,在自然界同一水體中,經(jīng)常可以有幾十種微藻共存,即浮游生物的反悖論。本研究發(fā)現(xiàn),注釋到種的微藻有60%自養(yǎng)型、10%異養(yǎng)型、30%混合營(yíng)養(yǎng)型。綠藻門、隱藻門、定鞭藻門基本是自養(yǎng)型,甲藻門都是異養(yǎng)型,混合營(yíng)養(yǎng)型除了綠藻門,其他門都有出現(xiàn)。四季平均每個(gè)站位獲得種水平上微藻的OTUs數(shù)為178個(gè),由于營(yíng)養(yǎng)模式不同,才得以共存同一水體中。

甲藻具有多種營(yíng)養(yǎng)模式,包括自養(yǎng)型、異養(yǎng)型、混合營(yíng)養(yǎng)型,能夠在低光照條件下利用微小的溶解有機(jī)物滿足其生長(zhǎng)和繁殖[14-16]。另外,一些光合自養(yǎng)型甲藻可與硅藻、隱藻、綠藻共生,還有一些寄生性甲藻含有葉綠體,具有混合營(yíng)養(yǎng)型的生理模式,相對(duì)于光合營(yíng)養(yǎng)型,混合營(yíng)養(yǎng)型的微藻生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)力更強(qiáng)[17-19]。

異養(yǎng)型微藻主要利用滲透營(yíng)養(yǎng)和吞噬營(yíng)養(yǎng)。滲透營(yíng)養(yǎng)可直接吸收溶解態(tài)有機(jī)物質(zhì),例如抑食金球藻通過滲透營(yíng)養(yǎng)吸收用于生長(zhǎng)的有機(jī)氮[20]。吞噬營(yíng)養(yǎng)通過吞噬其他藻類或者懸浮顆粒的方式獲得營(yíng)養(yǎng),特別是對(duì)C、N、P,甚至Fe的獲得,而這種營(yíng)養(yǎng)方式在有害藻類中比較常見,比如紅色赤潮藻(Akashiwosanguinea),塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)、伊姆裸甲藻(Gymnodiniumimpudicum)、多紋膝溝藻(Gonyaulaxpolygramma)、多環(huán)旋溝藻(Cochlodiniumpolykrikoides)、赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)[21-22],與嚴(yán)格的自養(yǎng)型相比,吞噬營(yíng)養(yǎng)作用能顯著提高某些有害藻類的生長(zhǎng)速率,例如多環(huán)旋溝藻(Cochlodiniumpolykrikoides)和多紋膝溝藻(Gonyaulaxpolygramma)。在藻華后期,營(yíng)養(yǎng)元素消耗殆盡,一些有害藻類會(huì)通過吞噬營(yíng)養(yǎng)方式維持種群密度。遼東灣不同季節(jié)營(yíng)養(yǎng)鹽含量的變化也會(huì)制約微藻的繁殖生長(zhǎng)。

從多樣性指數(shù)變化規(guī)律也可以了解微藻群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變化趨勢(shì),遼東灣海域微藻多樣性指數(shù)春、夏、秋、冬總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì),表明微藻群落結(jié)構(gòu)日趨穩(wěn)定,且在春、秋季近岸比離岸海域穩(wěn)定,夏、冬季離岸比近岸海域穩(wěn)定。當(dāng)然,本文進(jìn)行的物種多樣性和優(yōu)勢(shì)度研究是基于注釋微藻的序列數(shù)統(tǒng)計(jì)分析的,由于各微藻基因組中18S rDNA拷貝數(shù)不同,因此用各微藻序列數(shù)代表豐度統(tǒng)計(jì)可能存有偏差。

綜上,環(huán)境eDNA技術(shù)突破了微微型微藻傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定局限,可以精準(zhǔn)高效地檢測(cè)微藻群落結(jié)構(gòu),豐富了中國(guó)海域微藻名錄和外來海洋微藻背景數(shù)據(jù)庫[23]。總之,未來遼東灣海域的環(huán)境eDNA技術(shù)研究需要長(zhǎng)時(shí)間和高頻率的開展,進(jìn)而為赤潮、褐潮生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和區(qū)劃提供科學(xué)參考[24]。