活酵母對豬大腸體外產甲烷的抑制作用

孫秀青，趙紅麗

（鶴壁職業技術學院，河南鶴壁 458000）

隨著對抗生素使用的日益關注，飼料添加劑（如活性干酵母）被廣泛用于畜牧業，以提高動物生長性能和免疫力（仲偉光等，2018）。具有活性的干酵母也可以通過增加反芻動物丙酸濃度和產生同型乙酸的細菌數量來有效降低甲烷產量（許斌斌，2016）。瘤胃丙酸的生成可以作為氫氣的競爭途徑，而同型乙酸細菌可以利用二氧化碳和氫氣生成乙酸，其在反芻動物消化系統氫回收中扮演重要角色。未消化的碳水化合物在豬大腸內的發酵主要產生短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸以及氣體，如二氧化碳、氫氣和甲烷。此外，從能量效率和環境角度來看，甲烷和氫氣代表了能量的損失（Scheehle和 Kruger，2006）。雖然豬的腸內甲烷產量遠低于反芻動物，但由于前者養殖數量龐大，有必要對減少豬的甲烷產量進行調查。本研究旨在利用體外離體發酵技術，評估兩珠活酵母對豬大腸產甲烷的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試驗供體及體外培養 試驗選擇兩頭平均體重為60 kg的商品豬，飼喂以玉米和豆粕為基礎的日糧（表1），每天飼喂2次。飼養4周后對豬進行屠宰，收集大腸內容物作為接種物，定量轉移到塑料袋中，密封，在預加熱至39℃的水浴中孵育2 h。腸道內容物與緩沖液（碳酸氫鈉+碳酸氫銨）按1∶3的比例混合，4層紗布過濾。

表1 基礎日糧組成及營養成分

1.2 體外培育及樣品分析 酵母的濃度為1.8×1010個/g，兩種酵母分別以0.3 mg/mL和0.6 mg/mL的濃度添加。在兩個發酵箱中分別進行兩次24 h相同的孵育試驗，這兩個發酵箱接受相同的處理，每個處理重復3次。發酵結束后，使用氣密注射器從每個發酵箱中取出約50 mL的氣體樣本，轉移到氣體采樣袋中進行甲烷分析。注射器的內容物分別轉移EP管并在冰箱中保存，目的是阻止進一步發酵。以3500×g離心10 min，取上清液于EP管中，-80℃保存，用于隨后的揮發性脂肪酸分析。孵育殘渣用30 mL蒸餾水洗滌2次，60℃干燥至恒重，稱重計算體外干物質降解率。

1.3 數據計算與分析 計算乙酸、丙酸和丁酸的摩爾比（mmol/100 mmol），即樣品中揮發性脂肪酸的測定濃度除以揮發性脂肪酸的總濃度再乘以100。根據揮發性脂肪酸濃度和甲烷量估計氫釋放和回收率（Demeryer和 Degraeve，1991）。各組試驗數據均值用SAS軟件單因素方差分析模型，采用Duncan’s法進行多重比較，同時研究揮發性脂肪酸濃度與甲烷產量的相關性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 活酵母對豬大腸體外發酵干物質降解和氣體生成的影響 由表2可知。添加酵母后，總氣產量和甲烷產量顯著下降（P＜0.05），其中面包酵母組甲烷產量占比顯著低于對照組（P＜0.05）。兩種活酵母組甲烷降低百分比分布為10.1%和26.2%。0.6%釀酒酵母和0.3%面包酵母組干物質降解率最高（P＜0.05）。

表2 不同活酵母對豬大腸體外發酵干物質降解和氣體生成的影響

表3 不同活酵母對豬大腸體外發酵揮發性脂肪酸濃度的影響

2.2 活酵母對豬大腸體外發酵揮發性脂肪酸濃度的影響 由表3可知，補充0.6 mg/mL釀酒酵母和0.3 mg/mL面包酵母組丙酸、丁酸、戊酸及揮發性脂肪酸總量濃度顯著高于對照組（P＜0.05），而乙酸濃度有降低趨勢（P=0.09）。0.6 mg/mL面包酵母組及0.3和0.6 mg/mL釀酒酵母組丙酸、丁酸、戊酸比例顯著升高（P＜0.05），乙酸比例顯著降低（P＜0.05）。補充兩種酵母顯著降低了氫的回收率（P＜0.05）。

由表4可知，甲烷產量和乙酸占比及乙酸與丙酸比值呈顯著正相關（P＜0.05），而丙酸的比例與甲烷產量有顯著負相關趨勢（P=0.07）。

表4 甲烷生成與揮發性脂肪酸占比的相關性

3 討論

本研究選擇的兩株活酵母細胞主要是基于其增長率，結果僅顯示其對豬大腸內容物體外培養潛在的甲烷生成有抑制作用（表2）。這一結果與Lynch和Martin（2002）報道的結果一致，其發現釀酒酵母降低了瘤胃甲烷生產，但Lila等（2006）用混合瘤胃菌群分批培養未發現對甲烷的抑制作用。這些結果之間的差異可能與菌株特征、日糧組成和劑量有關。本研究中酵母處理組的總產氣量顯著下降，而在Lila等（2006）的報道卻有所增加，這可能與酵母處理中乙酸產量的下降有關，因為二氧化碳和氫氣是碳水化合物發酵過程中生成乙酸的副產物。較低的甲烷量與氣體總量比值表明活酵母可以降低甲烷生成量，但對氣體總量的降低無顯著影響。

補充0.6 mg/mL釀酒酵母和0.3 mg/mL面包酵母組丙酸、丁酸、戊酸及揮發性脂肪酸總量濃度顯著高于對照組，同時0.6 mg/mL面包酵母組及0.3和0.6 mg/mL釀酒酵母組丙酸、丁酸、戊酸比例顯著升高。當碳水化合物發酵成乙酸和丁酸時，作為甲烷合成主要底物的二氧化碳和氫氣生成，而丙酸的生成則作為有效氫氣的競爭途徑（Boadi等，2004）。乙酸和丁酸產量與甲烷量表現為顯著正相關，以及丙酸比例與甲烷產量有顯著負相關的趨勢，這一結果進一步證實了活酵母可以通過提高丙酸產量來抑制甲烷生成。

Chaucheyras等（1995）體外研究表明，即使在產甲烷菌存在的情況下，補充活酵母對同型產乙酸菌利用氫氣和產乙酸有有益影響。當甲烷產量降低時，氫濃度往往增加，同時同型乙酸均可以利用二氧化碳和氫氣產生乙酸，這在一些非反芻動物消化系統中發酵生成氫氣的再利用起重要作用。此外，硫化氫是在大腸中通過異化硫酸鹽還原作用產生的，如果提供足夠的硫酸鹽，該反應對氫的親和力更高，氫的閾值比產甲烷低（Zinder，1993）。雖然我們沒有檢測大腸內容物中的硫酸鹽濃度，但Ushida等（1995）在豬盲腸內容物中檢測到大約10 mmol/L的游離硫酸鹽，這足以使硫酸鹽進行還原反應。本研究的氫回收率僅在58%～65%之間，這可能是因為部分氫氣被用于生產硫化氫。較低的氫氣回收率表明，在豬后腸中存在還原性乙酸，這是乙酸的一個重要來源。此外，在本研究中，酵母處理組的氫氣回收率顯著下降（表3），同時，酵母補充組乙酸產量增加，甲烷產量降低，表明活酵母誘導了更高的乙酸生成。

4 結論

綜上所述，本研究使用的2種活酵母是潛在的腸內甲烷生成抑制劑。與對照組相比，釀酒酵母水平越高，面包酵母水平越低，干物質體外降解率、揮發性脂肪酸總量、丙酸產量越高。本研究結果表明，活酵母細胞通過改變發酵途徑，使丙酸產量高于乙酸和丁酸，從而降低氫氣量。