應用高通量測序研究人參皂苷Rh1對乳腺癌SKBR3細胞基因表達的影響

李秋華，鞠伶偉，劉兆喆，汪天青

應用高通量測序研究人參皂苷Rh1對乳腺癌SKBR3細胞基因表達的影響

李秋華1，鞠伶偉2，劉兆喆2，汪天青1

1.遼寧中醫藥大學附屬第二醫院，遼寧 沈陽 110034；2.北部戰區總醫院，遼寧 沈陽 110016

觀察人參皂苷Rh1對乳腺癌SKBR3細胞基因表達的影響，篩查人參皂苷Rh1干預下乳腺癌SKBR3細胞中差異表達的基因。對乳腺癌SKBR3細胞進行樣本準備，獲得去rRNA鏈特異性轉錄組；測序獲得原始圖像文件經堿基識別后轉化為原始序列文件；通過質量分析評估測序數據是否適合進行生物信息學分析，應用剪切轉錄產物比對軟件（STAR）對測序數據與參考基因組進行比對；基于美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫，對人參皂苷Rh1干預下乳腺癌SKBR3細胞基因的表達及差異基因的表達進行分析。高通量測序共篩查出基因26 978個，其中根據NCBI數據庫注釋為mRNA的基因19 229個，注釋為lncRNA的基因4385個，高通量測序結果表明差異表達基因6580個，以Fold change＞1為上調，＜-1為下調，上調差異基因3403個，其中差異表達顯著基因為小整合膜蛋白11A（SMIM11A）、嘌呤能受體P2X1（P2RX1）、碳酸酐酶9（CA9）、磷脂酰肌醇-3激酶催化亞基δ核糖核酸2（PIK3CD-AS2）、血管活性腸肽受體2（VIPR2）、非特征LOC100506314（LOC100506314）、長基因間非蛋白編碼核糖核酸1389（LINC01389）、表皮生長因子受體激酶底物8-樣蛋白3（EPS8L3）、視網膜筋膜基因2（FSCN2）、腸壁堿性磷酸酶（ALPI）；下調差異表達基因3177個，其中差異表達顯著基因為溶質載體家族1成員3（SLC1A3）、羥基類固醇17-β脫氫酶1（HSD17B1）、碳水化合物磺基轉移酶11（CHST11）、溶質載體家族25成員51（SLC25A51）、β-1,3-半乳糖基轉移酶6（B3GALT6）、非特征LOC101929882（LOC101929882）、δ連環蛋白家族成員（ARVCF）、蛋白磷酸酶2A催化亞基α（PPP2CA）、星形膠質細胞上調基因-1（AEG1）、磷脂酰肌醇-4-激酶B（PI4KB）。應用高通量測序技術可篩查出人參皂苷Rh1對乳腺癌SKBR3細胞增殖相關的差異性表達基因，并對篩選出的重要基因進行總結和分類。

乳腺癌；人參皂苷Rh1；SKBR3細胞；高通量測序

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，目前發病率居女性惡性腫瘤首位。人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）是乳腺癌分類和治療中的重要考量因素，普遍認為HER2過表達的乳腺癌患者預后較差，惡性程度較高，患者復發轉移的概率較高[1-3]。隨著分子生物學技術不斷發展，對生命、疾病研究目前已不再局限于某個基因位點，而是集中于全基因組研究。高通量測序技術較好地彌補了一代測序的不足，可一次檢測數千甚至數百萬的DNA堿基序列?，F代藥理研究發現，人參主要有效成分人參皂苷Rh1在抗腫瘤方面具有較高的藥用價值，對肺癌、胃癌、乳腺癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌均具有一定的治療效果[4-6]。目前關于人參皂苷Rh1在乳腺癌治療中的研究相對較少，本團隊前期采用MTS試驗以明確人參皂苷Rh1對乳腺癌SKBR3細胞活性的影響，并確定了人參皂苷Rh1治療干預的最佳藥物劑量[7]，本研究應用高通量測序技術篩選干預后差異表達基因，現報道如下。

1 實驗材料

1.1 藥物和細胞株

人參皂苷Rh1，上海純優生物制藥公司。人乳腺癌Her-2陽性細胞系SKBR3細胞，遼寧佰昊生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養基（美國Gibco，批號8117230），Roswell Park Memorial Institute 1640培養基（美國Gibco，批號12002-090），胎牛血清（FBS，北京索萊寶科技有限公司，批號20160525），胰蛋白酶（美國Gibco，批號27254-019），RNAiso Plus（瑞士羅氏，批號BK1122）。CO2組織細胞培養箱（美國Thermo，3111型），凈化工作臺（北京長城），-25 ℃低溫冰箱（青島海爾，DW-25L262），電熱恒溫水浴箱（BIOER），96孔細胞培養板（美國Corning，3599），倒置式金相顯微鏡（日本Olympus，GX41），聚合酶鏈反應核酸擴增儀（美國MJ.Research Inc.，PTC-200），全自動毛細管電泳系統（德國Qiagen，QIAxcel12-96），微量離心機（德國Thermo，17 000×）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養及給藥

細胞接種后，用含10%FBS PRMI1640，置于5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養，24 h換培養液1次。當細胞生長至80%～90%密度時進行細胞傳代。細胞給藥過程參照相關研究[7]。

2.2 總RNA提取

2.2.1 細胞破碎

棄培養液，PBS清洗細胞1次；加2 mL RNAiso Plus，輕輕晃動；將細胞裂解液移至離心管，反復吹吸，待裂解液中無明顯沉淀為止；室溫靜置5 min。

2.2.2 總RNA提取

裂解液中加入氯仿，渦旋乳液化；室溫靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；吸上清液至新的離心管，加入0.5～1倍RNAiso Plus體積異丙醇，顛倒混勻，靜置10 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min；棄上清液，加入等量75%乙醇，4 ℃、7500 r/min離心5 min，棄上清液；用RNase-free Water溶解沉淀。

2.3 總RNA質檢

以RNase-free Water作為空白，測定總RNA濃度和純度，QIAxcel Advanced檢測總RNA完整性，Nano Drop 1000檢測OD260/280≥1.5、OD260/230≥1.0，電泳圖像示樣品條帶完整，進行RNA分子完整性檢測[8]。

2.4 構建文庫

對乳腺癌SKBR3細胞進行樣本準備，獲得去rRNA鏈特異性轉錄組。總RNA中加帶Oligo d（T）磁珠，對mRNA進行富集。片段化處理：mRNA反轉錄；反轉錄合成cDNA，加入AMPure XP磁珠；純化cDNA末端補平磷酸化，cDNA的3’末端加poly（A）尾，連測序接頭，AMPure XP磁珠再次對cDNA進行純化；應用PCR技術進行文庫富集，AMPure XP磁珠純化PCR反應[9]。

2.5 測序分析

測序獲得原始圖像文件經堿基識別后轉化為原始序列文件。擴增cDNA片段中，dNTP熒光標記，高通量測序檢測與cDNA片段結合的dNTP信號，了解堿基信息[10]。

2.6 數據分析

通過質量分析評估測序數據是否適合進行生物信息學分析，應用剪切轉錄產物比對軟件（STAR）對測序數據與參考基因組進行比對。

2.6.1 RNA質控

一般以Q20及Q30值作為測序質量評價標準，read中N含量超過該read長度比例的10%，或read中含有低質量（Q≤5）堿基數超過該條read長度的50%，去除paired reads[11]。

2.6.2 差異表達基因的過濾與注釋

高通量測序后，過濾篩查的差異表達基因，過濾條件以RPKM、Fold change為依據，RPKM單邊＞0.5且雙邊不為0，Fold change＞1.5或＜0.666 7，基于美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫進行差異基因注釋歸納[12-13]。

3 結果

3.1 總RNA完整性檢測結果

毛細管電泳結果見圖1，M組為Marker，A～F 6組樣品總RNA 28 s/18 s面積比值均大于1，RIN值均大于7，完整性較好，符合實驗要求。

3.2 RNA質控結果

根據質控條件對每個測序循環的堿基組成及堿基質量進行統計，繪制堿基組成及堿基質量分布圖。測序樣本說明。實驗組：人參皂苷Rh1培養的乳腺癌SKBR3細胞（Rh1＋樣品序號1、2、3），對照組：無應用藥物培養的乳腺癌SKBR3細胞（S＋樣品序號1、2、3）。堿基質量值與錯誤率：sQ＝-10 log10?。

圖1 總RNA凝膠電泳圖

3.2.1 堿基組成分布

測序采用2*150堿基測序模式，每個樣本對應產生2個堿基組成的分布圖，見圖2。

圖2 堿基組成分布圖

3.2.2 堿基質量分布

堿基為橫坐標，對應Q值為縱坐標，紅線代表中位數，藍線表示平均值，黃色為25%～75%區間，觸須為10%～90%。見圖3。

圖3 堿基質量分布圖

3.3 read樣本分布結果

3.3.1 read樣本組成分布

R1樣本中的reads在基因組成分中分布見圖4。

圖4 R1樣本中reads在基因中分布

3.3.2 差異表達基因過濾與注釋結果

基因差異表達分析存在多種不同的軟件，其算法基于不同的統計學算法和統計學假設，因此獲取的差異表達基因結果差異很大，具體基因在不同樣本間比較過程中得到的值也可能存在較大差異，且在無生物學重復的情況下值意義不十分明顯。所以，我們以RPKM和Fold change為標準作為過濾條件，找到差異基因后，使用聚類分析判斷差異轉錄本基因在不同實驗條件下的表達模式，以不同實驗條件下的差異基因RPKM值為表達水平，使用層次聚類分析將表達模式相同或相近的基因聚集成類，并使用不同顏色的區域代表不同的聚類分組信息，從而判斷不同樣品或不同實驗條件下調控模式的聚類模式。

以Fold change＞1與＜-1的結果作為相應的上調與下調結果，Fold change閾值可根據具體樣本情況進行調整。共篩查出基因26 978個，NCBI數據庫注釋為mRNA的基因19 229個，注釋為lncRNA的基因4385個，篩查差異表達基因合計6580個。其中上調差異表達基因3403個，主要差異表達顯著基因為小整合膜蛋白11A（SMIM11A）、嘌呤能受體P2X1（P2RX1）、小整合膜蛋白11A（SMIM11A）、嘌呤能受體P2X1（P2RX1）、血管活性腸肽受體2（VIPR2）、非特征LOC100506314（LOC100506314）、長基因間非蛋白編碼核糖核酸1389（LINC01389）、表皮生長因子受體激酶底物8-樣蛋白3（EPS8L3）、視網膜筋膜基因2（FSCN2）、腸壁堿性磷酸酶（ALPI）。下調差異表達基因3177個，其中差異表達顯著基因為溶質載體家族1成員3（SLC1A3）、羥基類固醇17-β脫氫酶1（HSD17B1）、碳水化合物磺基轉移酶11（CHST11）、溶質載體家族25成員51（SLC25A51）、β-1,3-半乳糖基轉移酶6（B3GALT6）、非特征LOC101929882（LOC101929882）、δ連環蛋白家族成員（ARVCF）、蛋白磷酸酶2A催化亞基α（PPP2CA）、星形膠質細胞上調基因-1（AEG1）、磷脂酰肌醇-4-激酶B（PI4KB）。上調、下調差異基因前10位見表1、表2，差異表達基因過濾與注釋統計情況見表3。

表1 上調顯著差異表達基因

基因名稱 位置表達量差異表達倍數 樣本1樣本2 SMIM11Achr21：35747748-357614520.001 1.9251458.227 P2RX1chr17：3799884-38199600.043 5.737 132.145 CA9chr9：35673914-356811540.30028.377 94.332 PIK3CD-AS2chr1：9711789-98845840.020 1.911 91.549 VIPR2chr7：158820865-1589376490.028 1.910 69.543 LOC100506314chr12：13127798-131532430.009 0.580 63.543 LINC01389chr1：47846467-479063630.021 1.350 61.903 EPS8L3chr1：110292701-1103066440.018 0.952 54.339 FSCN2chr17：79495416-795041560.020 0.896 44.728 ALPIchr2：233320821-2333254550.013 0.529 43.547

表2 下調顯著差異表達基因

基因名稱 位置表達量差異表達倍數 樣本1樣本2 SLC1A3chr5：36606456-3668843628.83519.2320.667 HSD17B1chr17：40703983-40707232 1.059 0.7060.667 CHST11chr12：104850691-10515579214.076 9.3830.667 SLC25A51chr9：37877571-3790435010.775 7.1820.667 B3GALT6chr1：1167628-117042045.28630.1830.667 LOC101929882chr2：10181679-10183528 0.763 0.5090.666 ARVCFchr22：19863040-20004309 1.768 1.1780.666 PPP2CAchr5：133532147-133561950110.25773.4450.666 AEG1chr8：98656406-98742488 94.24362.7750.666 PI4KBchr1：151252499-151300191 42.17128.0860.666

表3 差異表達基因過濾與注釋統計情況（個）

名稱差異表達基因數 DEG6580 Up Regulate3403 Down Regulate3177 mRNA19 229 lncRNA4385 mRNA DEG5967 lncRNA DEG451

4 討論

高通量測序技術近年來被廣泛應用于各行各業，尤其在基因檢測中。轉錄組測序技術RNA-seq又稱全轉錄組鳥槍法測序，主要以高通量測序技術為基礎，將mRNA、small RNA和non-coding RNA等通過高通量測序技術檢測其堿基序列。本實驗通過該技術篩查藥物干預下差異表達基因，過濾條件干預后，發現乳腺癌SKBR3細胞中差異表達基因6580個：上調差異表達基因3403個，包括SMIM11A、P2RX1、CA9、PIK3CD-AS2、VIPR2、LOC100506314、LINC01389、EPS8L3、FSCN2、ALPI；下調差異表達基因3177個，差異表達顯著的基因為SLC1A3、HSD17B1、CHST11、SLC25A51、B3GALT6、LOC101929882、ARVCF、PPP2CA、AEG1、PI4KB。

人參皂苷Rh1作為人參皂苷主要組成成分之一，其抗腫瘤作用越發受到關注。陳聲武等[14]研究發現，人參皂苷Rh1在離體和整體情況下均有抗腫瘤作用，且人參皂苷Rh1的作用強于其前體人參皂苷Rg1，人參皂苷Rh1抗腫瘤作用與促進腫瘤壞死因子分泌及基因表達具有一定的相關性。孫倩[15]研究發現，人參皂苷Rh1對白血病K56細胞及人宮頸癌Hela細胞均有抑制作用。Yoon等[16]研究發現，人參皂苷Rh1可抑制C-Jun及C-fos的表達，下調MMP-1，進而抑制肝癌細胞侵襲轉移。Choi等[17]研究發現，人參皂苷Rh1可抑制Juk、p38MAPK磷酸化，從而抑制MAPK信號通路，進而抑制腫瘤侵襲轉移。魏然等[18]研究發現，人參皂苷Rhl可通過抑制MMP-9表達，進而抑制人結腸癌細胞SW480的侵襲轉移。

目前大多數惡性腫瘤的病因和機制尚不十分清晰，而在臨床工作中，應用針對性的檢測分析，對干預治療和個體化指導用藥均有積極意義。應用高通量測序技術可篩查人參皂苷Rh1對乳腺癌SKBR3細胞增殖有關的差異性表達基因，并對篩選出的重要基因進行總結和分類。依據本次篩查發現的差異表達基因情況，我們對差異表達基因的表達情況進行層次聚類分析，應用京都基因和基因組百科全書數據庫進行生物信息學富集分析，對差異表達基因功能及相關信號通路進一步分析發現，差異表達基因在人類乳頭瘤病毒感染、剪接體、基底黏附、細胞凋亡及mTOR、MAPK、TNF、泛素-蛋白酶體信號通路等富集結果顯著，表明人參皂苷Rh1可能通過這些信號通路對乳腺癌SKBR3細胞的活性進行抑制[7]，這對于進一步探索藥物作用靶點及分子機制具有重要意義。

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Effects of Ginsenoside Rh1 on Gene Expression of Breast Cancer SKBR3 Cells by High Throughput Sequencing

LI Qiuhua1, JU Lingwei2, LIU Zhaozhe2, WANG Tianqing1

To determine the effects of ginsenoside Rh1 on gene expression of breast cancer SKBR3 cells; To screen the differentially expressed genes in breast cancer SKBR3 cells under the intervention of ginsenoside Rh1.Samples of breast cancer SKBR3 cells were prepared to obtain rRNA chain-removed specific transcriptome. The original image file obtained by sequencing was transformed into the original sequence file after base recognition. After quality analysis, the sequencing data were evaluated whether suitable for bioinformatics analysis and the sequencing data were compared with the reference genome by using STAR software. Based on the NCBI database, the gene expression level and differential gene expression of SKBR3 cells under the intervention of ginsenoside Rh1 were screened and annotated.Through high throughput sequencing technology, a total of 26 978 genes were screened, of which 19 229 genes were annotated to mRNA and 4385 genes were annotated to lncRNA according to the NCBI database. High throughput sequencing showed 6580 differentially expressed genes. Fold change value greater than 1 was used as up-regulation, less than -1 as down-regulation. There were 3403 differentially expressed genes up-regulated, including SMIM11A (small integral membrane protein 11A), P2RX1 (purinergic receptor P2X1), CA9 (carbonic anhydrase 9), PIK3CD-AS2 (PIK3CD antisense RNA 2), VIPR2 (vasoactive intestinal peptide receptor 2), LOC100506314 (uncharacterized LOC100506314), LINC01389 (long intergenic non-protein coding RNA 1389), EPS8L3 (epidermal growth factor receptor kinase substrate 8-like protein 3), FSCN2 (fascin gene 2), ALPI (alkaline phosphatase, intestinal). There were 3177 down-regulated genes, including SLC1A3 (solute carrier family 1 member 3), HSD17B1 (hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 1), CHST11 (carbohydrate sulfotransferase 11), SLC25A51 (solute carrier family 25 member 51), B3GALT6 (beta-1,3-galactosyltransferase 6), LOC101929882 (uncharacterized LOC101929882), ARVCF (delta catenin family member), PPP2CA (protein phosphatase 2 catalytic subunit alpha), AEG1(astrocyte elevated gene-1 protein), and PI4KB (phosphatidylinositol 4-kinase beta).This study screens out the differentially expressed genes of ginsenoside Rh1 related to the proliferation of SKBR3 cells by high throughput sequencing technology, and summarizes and classifies the important genes.

breast cancer; ginsenoside Rh1; SKBR3 cells; high throughput sequencing

R285.5

A

1005-5304(2020)10-0048-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202003727

遼寧省中醫藥臨床學（專）科能力建設項目（2017年）；遼寧省博士啟動基金（20180540043）；遼寧省自然科學基金（2019-MS-351）

汪天青，E-mail：34318974@qq.com；劉兆喆，E-mail：lzz_summer@126.com

（2020-03-27）

（2020-04-09；編輯：華強）