宮頸癌患者外周血小核仁RNA宿主基因1表達(dá)及臨床意義

陳琳，趙松蘭，左亞敏，曹杰

鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病機(jī)制涉及病毒感染、營(yíng)養(yǎng)不良、環(huán)境污染等多種因素，而進(jìn)一步的深入研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，常伴有原癌基因或抑癌基因的調(diào)控異常[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long chain non-coding RNA，lncRNA）是指長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的非編碼RNA，可通過(guò)表觀調(diào)控染色質(zhì)沉默、調(diào)控轉(zhuǎn)錄、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合微小RNA（microRNA，miRNA）調(diào)控靶基因表達(dá)等途徑而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[2-3]。小核仁RNA宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1）是由內(nèi)含子編碼的U22小核仁RNA（intron-encoded U22 small nucleolar RNA，UHG）轉(zhuǎn)錄而來(lái)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，位于11號(hào)染色體[4-5]。已有研究報(bào)道，SNHG1異常表達(dá)與多種腫瘤密切相關(guān)，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、食道癌、胃癌等，其表達(dá)異常可能與腫瘤患者的生存和預(yù)后有關(guān)[6-10]，但關(guān)于SNHG1在宮頸癌中表達(dá)的研究相對(duì)較少。因此，本研究擬通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）檢測(cè)和分析SNHG1在宮頸癌中的表達(dá)，及其與患者預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2011年5月至2018年9月鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院收治的56例宮頸癌患者，作為宮頸癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理學(xué)活檢確診為宮頸癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；1個(gè)月內(nèi)曾經(jīng)有輸血史。56例宮頸癌患者，年齡37～78歲，平均（58.54±8.46）歲；年齡＞45歲26例，≤45歲30例；體重指數(shù)（body mass index，BMI）19.59～26.04 kg/m2，平 均（22.76±4.79）kg/m2；合并人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染30例，未合并HPV感染26例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期31例；分化程度：低分化21例，中分化15例，高分化20例；病理類(lèi)型：鱗狀細(xì)胞癌39例，非鱗狀細(xì)胞癌17例；腫瘤大小：≥4 cm 26例，＜4 cm 30例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例；術(shù)后復(fù)發(fā)29例，術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)27例。隨機(jī)同期選取在本院進(jìn)行健康體檢的30例健康者作為對(duì)照組，年齡36～75歲，平均（57.56±7.36）歲；BMI為 19.92～26.37 kg/m2，平均（21.86±5.24）kg/m2。兩組受試者年齡、BMI比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。收集上述宮頸癌患者和對(duì)照組受試者的靜脈血，同時(shí)取56例宮頸癌患者的宮頸癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織，保存待檢。

1.2 定量RT-PCR法檢測(cè)SNHG1mRNA的相對(duì)表達(dá)量

宮頸癌患者于入院次日清晨，對(duì)照組受試者于體檢當(dāng)日清晨抽取空腹靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝處理，1000 r/min離心5 min后，除去上清，采用1 ml的Trizol吹勻細(xì)胞沉淀，參照Trizol法提取總RNA后，經(jīng)隨機(jī)六聚體引物法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。手術(shù)切除的宮頸癌組織和癌旁組織離體后及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)至液氮保存，研磨獲取細(xì)胞，再參照上述Trizol法提取總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體積 20 μl，包含 AceQTMqPCR SYBR Green Master Mix 10 μl，ROX 0.4 μl，SNHG1上下游引物各 0.8 μl，雙蒸水 6 μl，cDNA 2 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s；58℃退火30 s；反應(yīng)條件：95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s、60℃15 s。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算SNHG1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。SNHG1上游引物：5'-TGGTGAAGGAATGGGACA-3'，下游引物 ：5'-CAAGCAGGTTATTGGTTAGT-3'；GAPDH上游引物：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGG-3'，下游引物：5'-TGGAAGATGGTGATGGGAT-3'。

1.3 隨訪方法

根據(jù)初診時(shí)留取的患者聯(lián)系方式，每個(gè)月通過(guò)電話的方式直接向患者或其家屬了解患者的病情和生存情況。若隨訪時(shí)患者仍存活，則記錄下隨訪時(shí)間；若隨訪時(shí)患者已死亡，則記錄患者的具體死亡時(shí)間和死因。從患者出院后第1個(gè)月開(kāi)始至隨訪截止時(shí)間（2018年9月），每月電話隨訪1次，直至患者死亡。在隨訪患者無(wú)病生存信息時(shí)，有7例患者無(wú)法獲取其準(zhǔn)確的疾病復(fù)發(fā)及死亡時(shí)間，因此，未納入無(wú)病生存分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，組間比較采用 Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；以受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線和曲線下面積（area under curve，AUC）評(píng)估SNHG1的表達(dá)對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值；不同組間變量的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNHG1mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較

宮頸癌患者外周血SNHG1mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.675（0.312，1.700），明顯高于對(duì)照組受試者的0.136（0.016，0.373），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=276.000，P＜0.01）。宮頸癌患者宮頸癌組織中SNHG1mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.869（0.419，1.992），明顯高于癌旁組織的0.122（0.024，0.299），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=177.000，P＜0.01）。

2.2 SNHG1表達(dá)與宮頸癌的診斷效能

ROC曲線結(jié)果顯示，SNHG1表達(dá)診斷宮頸癌的AUC為0.836（95%CI：0.748～0.924），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（圖1）

圖1 SNHG1表達(dá)診斷宮頸癌的ROC曲線

2.3 不同臨床特征宮頸癌患者外周血中SNHG1表達(dá)情況的比較

以外周血SNHG1mRNA相對(duì)表達(dá)量0.551為界，SNHG1高表達(dá)宮頸癌患者30例，SNHG1低表達(dá)宮頸癌患者26例。不同年齡、HPV感染情況、分化程度、病理類(lèi)型和腫瘤大小宮頸癌患者外周血中SNHG1表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)的宮頸癌患者外周血中SNHG1呈低表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

2.4 相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，宮頸癌患者外周血SNHG1的表達(dá)與宮頸癌組織中SNHG1的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.785，P＜0.01）。

2.5 預(yù)后情況的比較

SNHG1高表達(dá)宮頸癌患者的總生存時(shí)間為17.83（9.18，25.35）個(gè)月，明顯短于SNHG1低表達(dá)患者的31.11（24.28，39.85）個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.854，P=0.002）（圖2）。SNHG1高表達(dá)患者的無(wú)病生存時(shí)間為14.83（8.30，22.31）個(gè)月，與SNHG1低表達(dá)患者的27.27（15.39，40.18）個(gè)月比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.354，P=0.245）。

3 討論

越來(lái)越多的研究證實(shí)，SNHG1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可發(fā)揮重要作用。既往研究報(bào)道顯示，SN-HG1在結(jié)腸癌、胰腺癌、骨肉瘤、非小細(xì)胞肺癌、肝癌等多數(shù)實(shí)體瘤中發(fā)揮促癌分子作用[9-13]，其分子機(jī)制主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性吸附miRNA，從而上調(diào)癌性編碼基因，形成腫瘤[9,11-12]。此外，SNHG1還可通過(guò)直接靶向調(diào)控特異性的信號(hào)通路，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。與上述基礎(chǔ)研究不同，本研究主要探討SNHG1在宮頸癌外周血中的表達(dá)，結(jié)果顯示，宮頸癌患者外周血中SNHG1的表達(dá)上調(diào)，這與SNHG1在其他的腫瘤中表達(dá)上調(diào)一致。此外，Liu等[14]檢測(cè)宮頸癌組織和細(xì)胞系中SNHG1呈高表達(dá)，并敲低SNHG1的表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞HeLa和C-33A的增殖、遷移及侵襲能力均降低。以上結(jié)果均表明，SNHG1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能扮演促癌基因的作用，但仍需體外機(jī)制研究及體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)SNHG1的功能。

表1 不同臨床特征宮頸癌患者SNHG1表達(dá)情況的比較

圖2 SNHG1高表達(dá)（n=30）與SNHG1低表達(dá)（n=26）宮頸癌患者的總生存曲線

此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNHG1可能作為潛在的分子標(biāo)志物輔助宮頸癌的診斷和預(yù)后，ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，SNHG1輔助診斷宮頸癌的靈敏度和特異度均較高，且SNHG1的表達(dá)與宮頸癌患者的預(yù)后也密切相關(guān)。同樣，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，SNHG1過(guò)表達(dá)常提示預(yù)后不良，可能作為潛在的分子標(biāo)志物對(duì)腫瘤診斷、預(yù)后判斷發(fā)揮重要作用[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，SNHG1高表達(dá)可能與較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和術(shù)后復(fù)發(fā)率有關(guān)，這也為患者的不良預(yù)后提供了一定的理論依據(jù)。

除檢測(cè)外周血中SNHG1的表達(dá)外，本研究還檢測(cè)了宮頸癌組織和癌旁組織中SNHG1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，宮頸癌患者外周血中SNHG1的表達(dá)與宮頸癌組織呈正相關(guān)。與病理組織的檢測(cè)相比，具有創(chuàng)傷小、易獲得的特點(diǎn)，表明外周血中的SNHG1可能是代替腫瘤組織的潛在新型腫瘤標(biāo)志物。這也為后續(xù)宮頸癌患者的療效評(píng)估提供了一種便捷可能性，具有較為實(shí)際的臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，宮頸癌患者外周血SNHG1的表達(dá)上調(diào)，是宮頸癌輔助診斷及預(yù)后評(píng)估的潛在分子標(biāo)志物。