siRNA介導Rsf-1/HBXAP對子宮內膜癌細胞生物學功能的影響

王孟君，劉從會，張娟，尹紅

(安康市中心醫院婦科，陜西 安康 725000)

子宮內膜癌是女性常見的惡性腫瘤之一，在生殖系惡性腫瘤中排名第二，僅次于子宮頸癌，近年來有上升趨勢且年輕化，引起臨床工作者和科研工作者的重視[1-2]。目前手術仍是子宮內膜癌的主要治療方式，其他單純放化療及激素治療效果欠佳，分子診療仍無明顯進展[3-4]。染色體空間重組因子1(remodeling and spacing factor-1,Rsf-1；又名hepatitis BX-antigen associated protein,HBXAP)是人類核心組蛋白及染色質組裝相關因子家族重要成員之一，位于人染色體11q13.5上，最早在人HeLa細胞核中發現，是人體腫瘤最常見擴增區域之一[5]。近年來研究發現，Rsf-1/HBXAP在乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、胃癌及肺癌等惡性腫瘤中均高表達，多以“促癌基因”角色參與腫瘤的發生、發展[6-7]。但目前關于其與子宮內膜癌的研究較少見。本研究通過免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)和實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測子宮內膜癌組織和細胞中Rsf-1/HBXAP表達情況，利用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默Rsf-1/HBXAP并探討其對子宮內膜癌細胞增殖、凋亡和侵襲的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年2月至2018年3月安康市中心醫院收治的80例子宮內膜癌患者作為研究對象，年齡25～68歲，TNM分期Ⅰ～Ⅱb期，患者均行手術治療，且病理結果確診為子宮內膜癌，病理科保存有癌組織和癌旁正常組織蠟塊者；排除合并其他惡性腫瘤者。本研究通過安康市中心醫院倫理委員會批準，患者均簽署了知情同意書。

1.2試劑與儀器 子宮內膜癌細胞系Ishikawa細胞和HEC-1-A細胞均購自中國科學院上海生命科學院生化細胞所，脂質體Lipofectamine 2000、總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和Applied BiosystemsTMSYBRTMGreen試劑盒均購自美國Thermo Fisher Scientific公司(批號：4368702)；Rsf-1/HBXAP、兔抗人單克隆抗體和鼠抗兔二抗均購自美國Abcam公司；細胞計數試劑盒-8(cell counting Kit-8,CCK-8)和細胞凋亡試劑盒購自美國ABI公司(批號：EC008)；Transwell小室購自美國BD公司；Rsf-1/HBXAP引物及對應siRNA均由山東維真生物科技有限公司完成。Light Cycle PCR儀購自瑞士Roche公司；IX51型號倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；CytoFLEX流式細胞儀購自美國Beckman公司。

1.3方法

1.3.1IHC檢測Rsf-1/HBXAP蛋白表達 從石蠟包塊中切取組織切片，并嚴格按照說明書進行脫蠟、水化、抗原修復、添加一抗(1∶300)、添加二抗、二氨基聯苯胺染色、復染、脫水、透明及封片，最后由兩名高級病理科醫師進行鏡檢判斷(始終保持雙盲原則)。判斷方法：由以上醫師在每張玻片上選取具有代表性的5個高倍鏡視野進行觀察計數，Rsf-1/HBXAP蛋白主要位于細胞質，腫瘤細胞胞質呈棕黃色為陽性細胞，根據著色強度不同記分：棕褐色3分、棕黃色2分、淡棕黃色1分和無著色0分；根據著色細胞數不同記分：無陽性細胞0分、≤10% 1分、11%～50% 2分、51%～75% 3分和>75% 4分；將著色強度計分和著色細胞數計分相乘>3分者為陽性，陽性率=陽性例數/總例數×100%[8]。

1.3.2細胞培養 Ishikawa細胞和HEC-1-A細胞均接種于10%胎牛血清-高糖杜爾貝科改良伊格爾培養基上，并于5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養箱進行培養。

1.3.3qRT-PCR檢測Rsf-1/HBXAP mRNA表達 取對數生長期子宮內膜癌Ishikawa細胞和HEC-1-A細胞進行單細胞重懸，調整細胞密度為1×105個/L，取1 mL細胞重懸液檢測Rsf-1/HBXAP mRNA，嚴格按照說明書進行總RNA提取、cDNA制備和qRT-PCR，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為參考基因，分析Rsf-1/HBXAP mRNA相對表達水平(2-ΔΔCt，ΔCt=Rsf-1/HBXAPCt-GAPDHCt)，其中Rsf-1/HBXAP上游引物為5′-G ATACTATGCGTCTCCAGCCAA-3′,下游引物為5′-CAACTCGTGTTTCGATTTCTGACAA-3′。選取Rsf-1/HBXAP mRNA含量高的子宮內膜癌Ishikawa細胞進行后續實驗。

1.3.4細胞分組和siRNA轉染 將Ishikawa細胞共分為3組[9]：siRNA-Rsf-1/HBXAP組、陰性對照組和空白對照組，其中siRNA-Rsf-1/HBXAP組轉染Rsf-1/HBXAP-siRNA，陰性對照組轉染陰性對照-siRNA，空白對照組轉染等量0.9%氯化鈉溶液，轉染具體步驟參照脂質體Lipofectamine 2000試劑說明書進行，轉染完成后繼續進行細胞培養，熒光顯微鏡下觀察轉染情況，并用qRT-PCR檢測各組細胞Rsf-1/HBXAP mRNA表達水平以確認轉染是否成功。

1.3.5CCK-8法檢測細胞增殖 分別取轉染完成后第1天、第3天和第5天對數生長期的siRNA-Rsf-1/HBXAP組、陰性對照組和空白對照組細胞進行單細胞重懸，并調整其密度，后將其置于96孔板上，保證每孔1×103個，嚴格按照說明書向每孔中添加10 μL CCK-8溶液，繼續培養2 h后將其置于酶標儀450 nm處檢測各孔吸光度值(optical density，OD)。實驗重復3次。

1.3.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 分別取轉染完成后第1天、第3天和第5天對數生長期的siRNA-Rsf-1/HBXAP組、陰性對照組和空白對照組細胞進行單細胞重懸，并調整其密度，后將其置于96孔板上，保證每孔1×105個，繼續培養待細胞融合度為80%時參照操作說明書分別添加碘化丙啶和膜聯蛋白進行染色(標記熒光素異硫氰酸熒光素)，1 h后將其置于流式細胞儀中進行檢測并計算細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.3.7Transwell法檢測細胞侵襲 分別取轉染完成后第1天、第3天和第5天對數生長期的siRNA-Rsf-1/HBXAP組、陰性對照組和空白對照組細胞進行單細胞重懸，并調整其密度為1×108個/L，將100 μL細胞置于Transwell小室上層(不含基質膠)，將500 μL杜爾貝科改良伊格爾培養基溶液(含20%胎牛血清)置于Transwell小室下層，繼續培養2 d，用棉簽抹去小室上層細胞后將其固定，緩沖液洗滌后用0.1%結晶紫染色，后于倒置顯微鏡下隨機選取10個視野進行細胞計數，取平均值為最終結果。實驗重復3次。

2 結 果

2.1子宮內膜癌癌組織和癌旁正常組織中Rsf-1/HBXAP蛋白比較 子宮內膜癌癌組織Rsf-1/HBXAP蛋白陽性率高于癌旁正常組織[77.50%(62/80)比18.75%(15/80)](χ2=55.303，P<0.001)。見圖1。

2.2不同子宮內膜癌細胞系Rsf-1/HBXAP mRNA比較 子宮內膜癌Ishikawa細胞和HEC-1-A細胞Rsf-1/HBXAP mRNA表達水平分別為1.34±0.16和1.02±0.28，比較差異有統計學意義(t=9.923,P<0.001)。

1a:子宮內膜癌癌組織Rsf-1/HBXAP蛋白陽性；1b：子宮內膜癌癌組織Rsf-1/HBXAP蛋白陰性

2.3各組細胞Rsf-1/HBXAP mRNA比較 siRNA-Rsf-1/HBXAP組、陰性對照組和空白對照組細胞Rsf-1/HBXAP mRNA分別為0.22±0.04、1.37±0.17和1.30±0.15，3組比較差異有統計學意義(F=103.482,P<0.001)，其中siRNA-Rsf-1/HBXAP組低于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)，說明轉染成功，轉染72 h后各組熒光顯微鏡下圖見圖2。

2.4沉默Rsf-1/HBXAP對子宮內膜癌細胞增殖的影響 第1天、第3天、第5天細胞OD值的主效應差異有統計學意義(P<0.05)；不考慮測量時間，各組間細胞OD值的主效應差異有統計學意義(P<0.05)；細胞OD值的組間和時點間存在交互作用(P<0.05)，各組第3天、第5天細胞OD值呈升高趨勢，siRNA-Rsf-1/HBXAP組各時點間OD值低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)。見表1。

2.5沉默Rsf-1/HBXAP對子宮內膜癌細胞凋亡的影響 第1天、第3天、第5天細胞凋亡率的主效應差異有統計學意義(P<0.05)；不考慮測量時間，各組間細胞凋亡率的主效應差異有統計學意義(P<0.05)；細胞凋亡率的組間和時點間存在交互作用(P<0.05)，空白對照組和陰性對照組第3天、第5天的細胞凋亡率呈下降趨勢，siRNA-Rsf-1/HBXAP組呈升高趨勢，siRNA-Rsf-1/HBXAP組各時點間細胞凋亡率均高于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)。見表2。

siRNA:小干擾RNA；Rsf-1/HBXAP:染色體空間重組因子1

表1 各組細胞OD值比較

表2 各組細胞凋亡率比較

2.6沉默Rsf-1/HBXAP對子宮內膜癌細胞侵襲的影響 第1天、第3天、第5天侵襲細胞數的主效應差異有統計學意義(P<0.05)；不考慮測量時間，各組間侵襲細胞數的主效應差異有統計學意義(P<0.05)；侵襲細胞數的組間和時點間存在交互作用(P<0.05)，空白對照組和陰性對照組第3天、第5天的侵襲細胞數呈升高趨勢，siRNA-Rsf-1/HBXAP組呈下降趨勢，siRNA-Rsf-1/HBXAP組各時點間侵襲細胞數均低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)。見表3。

表3 各組侵襲細胞數比較 (n=3,個,

3 討 論

近年來，隨著分子生物技術的不斷進步，學者們對子宮內膜癌的分子機制研究逐漸增多，其發生、發展是多基因改變和信號轉導通路異常互相作用的復雜連鎖過程，但仍未明確可服務臨床的有效標志物[10-11]。Rsf-1/HBXAP最早于HeLa細胞核中發現，隨后在人類各腫瘤組織中均有報道，且多高表達，是近年來發現的新型腫瘤標志物之一[12-13]。Rsf是一種復合物，包括Rsf-1和人類不發酵蔗糖蛋白2同源物兩種亞型，且均定位于細胞核，可調節染色質結構以適應各種生長信號和環境變化需求，若Rsf異常升高可導致細胞在基因水平上失去對細胞生長的正常調控而出現異常增生，進而形成局部腫塊[14-15]。目前研究提示，Rsf-1主要作為一個致癌基因參與細胞增殖及惡性轉化過程，這是因為其可與人類不發酵蔗糖蛋白2同源物在細胞核內結合成染色質重塑復合物Rsf，以促進腫瘤細胞的修復與重構，從而逃避死亡，Rsf-1還與腫瘤細胞增殖能力、侵襲能力、惡性程度、耐藥及染色體穩定性相關[16-17]。Choi等[18]在卵巢癌研究中發現Rsf-1/HBXAP可通過與細胞周期蛋白E結合促進癌細胞增殖。Liu等[19]在乳腺癌研究中發現干擾Rsf-1表達能有效抑制乳腺癌MCF-7和SKBR-3細胞增殖，促進其凋亡，有望成為乳腺癌治療的新靶點。Wang等[20]通過IHC、Kaplan-Meier分析及siRNA等方法發現RSF-1參與宮頸癌的腫瘤進展，可作為癌癥發展和臨床結局的早期預后指標，且認為抗RSF-1活性治療對RSF-1過表達宮頸癌患者有益。

在本研究中，通過IHC檢測發現Rsf-1/HBXAP蛋白在子宮內膜癌組織中陽性率顯著高于癌旁正常組織，提示Rsf-1/HBXAP主要作為一個癌基因存在于子宮內膜癌細胞，以促進其發生發展，為后續研究提供了臨床理論基礎。目前，已有大量研究證明Rsf-1/HBXAP可提高腫瘤細胞增殖及侵襲能力，并同時抑制其凋亡能力，使用Rsf-1/HBXAP拮抗劑或Rsf-1/HBXAP-siRNA可幫助抑制細胞增殖、促進凋亡[21-22]。本研究采用qRT-PCR法選取較高表達Rsf-1/HBXAP的Ishikawa細胞進行后續探討，并通過siRNA介導沉默Rsf-1/HBXAP以分析其對子宮內膜癌生物學功能的影響，結果顯示，空白對照組和陰性對照組細胞增殖、侵襲能力比較差異無統計學意義，排除了轉染本身對癌細胞的影響；siRNA-Rsf-1/HBXAP組水平最弱，提示沉默Rsf-1/HBXAP可明顯抑制子宮內膜癌細胞增殖和侵襲能力。而在細胞凋亡能力上，siRNA-Rsf-1/HBXAP組水平最強，提示Rsf-1/HBXAP在子宮內膜癌發生發展中發揮一定作用，為其診療提供了一個新的方向，是本研究重要創新之處。

綜上所述，Rsf-1/HBXAP在子宮內膜癌中高表達，沉默Rsf-1/HBXAP在降低癌細胞增殖及侵襲能力的同時可增強其凋亡能力，但具體作用機制尚不清楚，有待后續探討。